[发明专利]核酸分析

说明书

本发明涉及一种分析在样品(例如，生物来源的液体样品，例如，体液，诸如血液、尿、CSF或痰液，或由组织制备的样品，例如，通过匀浆制备的样品)中存在或不存在特定(“靶标”)核酸序列的方法。本发明更具体地涉及，但不必排除，用于医学病症的诊断的此类方法，所述医学病症诸如由所述靶标核酸序列在样品中的存在表示。例如，所述靶标核酸序列可以是一种与“野生型”序列相比具有一个或多个点突变的序列。

分析生物来源的样品以检测特定核酸序列的存在是得到确认的科学，并且常规用于分析液体样品(例如，体液，诸如血液、尿、CSF或痰液，或由组织制备的样品，例如，通过匀浆制备的样品)从而鉴定特定医学病症的目的。例如，所述医学病症可以是由已经“侵入”患者身体并且特征在于在感染的生物体内存在特定的核酸序列的细菌或病毒引起的感染。进一步的可能性是检测这样的遗传病症，所述遗传病症特征在于在健康个体中存在的“野生型”序列中的一个或多个点突变。另一种可能性是用于这样的情形：其中已知患者患有某种医学病症，但是对给所述医学病症所处方的治疗可能受与所述医学病症相关的核酸序列中是否存在一个或多个点突变影响。因此，例如，已知结直肠癌中K-ras基因的突变状态可能影响患者对西妥昔单抗(Cetuximab)(一种单克隆抗体，其处方用于患有结直肠肿瘤并且对化疗没有响应的患者(Karapetis，C.S.，等人，2008))治疗的响应。

多种此类确定靶标核酸序列存在或不存在于样品中的样品(例如，血液、尿、CSF、组织和痰液)分析通常每天由医院、医生诊疗室和其他医学中心进行，并且通常需要将患者的样品送到实验室(其可以在该医学中心处)进行分析程序。此类分析通常利用使用靶标核酸序列(如果存在)扩增到可检测水平的程序进行。qPCR是一种这样的分析方法。然而，如果没有正确地进行，所述方法(即，涉及核酸扩增的那些方法)的缺点在于一旦形成则导致放大的阴性(无结果的)信号的错配的可能性。所述方法的另一个缺点是它们通常需要冗长的凝胶显色步骤或柱分离步骤才能得到结果，然后这可能需要专业的解释。由此，在采集样品的时刻与医学从业者可获得结果然后能够开出任意需要的治疗的时刻之间可能经过一些相当长的时间。

如所示的，还存在与qPCR相关联的缺点，原因在于其倾向于“假阳性”(即，当核酸不存在时，表示在样品中存在该特定的核酸)，并且可能不总是能够确定一个或多个点突变在核酸序列中的存在。

需要这样的核酸分析方法：其容易进行，其给出快速且准确的结果，并且其能够可靠地用于确定靶标核酸序列中的点突变。本发明解决这一需求。

按照本发明，提供一种用于分析在样品中存在的或可能存在的靶标核酸中的单链靶标核酸序列的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)提供一种询问双链体核酸结构(interrogating duplex nucleic acid structure)，其包含：

(a)第一报道子链，其可与靶标链(如果在样品中存在)中的单链靶标核酸序列特异性杂交，并且其在其一个末端或对其一个末端用能够提供可检测信号的报道子结构部分标记，所述报道子链被这样设置，以使在通过所述第一报道子链与所述单链靶标核酸序列的杂交所形成的报道子/靶标双链体结构中，所述报道子链可以从其与所述报道子结构部分相对的末端被选择性酶促消化，从而释放所杂交的单链靶标核酸序列和所述报道子结构部分；和

(b)第二可替换的链，其短于所述第一报道子链，并且与第一报道子链杂交形成所述询问双链体核酸结构，其中所述报道子链提供询问突出端，

(ii)提供能够执行包含所述报道子链和靶标核酸序列的双链体结构中的报道子链的所述选择性酶促消化的酶，和

(iii)在所述单链靶标核酸序列(如果存在)替换所述询问双链体核酸结构的第二链并且与所述报道子链杂交，随后酶促消化所述报道子链的条件下，进行分析，和

(iv)直接或间接地检测报道子结构部分的存在。

如下文更充分地描述的，本发明的方法提供信号放大的显著益处，从而在无需扩增靶标序列本身的条件下，由样品中存在的低水平的靶标核酸序列提供可检测的信号。因此，避免了由核酸扩增程序过程中的错配导致的“假阳性”。此外，本发明的方法可以以提供可容易读取的且可准确检测的信号的形式进行，所述信号在短时间期间(例如，15-30分钟，取决于样品中存在的靶标核酸链(包含靶标序列)的量和/或测定所需要的灵敏性)内获得，由此，与上文讨论的现有领域技术相比，相当大地减少获取分析结果所花费的时间。