[发明专利]多程测序

说明书

提供了改进的单分子测序方法、组合物和装置。在第一方面，本发明提供使用纳米孔测序对靶序列进行测序的多程方法，所述方法包括：i)提供包含所述靶序列的多个拷贝的非天然存在的多联体核酸分子；ii)对所述多联体中的所述靶序列的至少三个拷贝进行纳米孔测序，由此获得多程序列数据集，其中所述多程序列数据集包含所述靶序列的所述至少三个拷贝的靶序列数据集；以及iii)使用所述多程序列数据集来确定所述靶序列。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年11月11日提交的美国临时申请No.62/078,306的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。

背景技术

单分子测序(SMS)方法，例如纳米孔测序，具有优于其他下一代测序方法的一些优点。特别地，SMS是快速的并且产生长的阅读长度。然而，常规的SMS方法的特征在于原始阅读中的高错误率。错误率可以表示为％错误，对应于每100个调用碱基的错误数。替代地，错误率可以表示为“Q”值。可以使用以下公式计算“Q”：-10×log₁₀(P)，其中P是错误碱基调用(base call)的概率。参见EwingGreen，1998，GenomeRes.8：186-194。例如，Q10指的是1/10的误差概率，或90％的精确度，而Q30是指1/1000的误差概率，或99.9％的精确度。据报道，纳米孔测序提供了仅在Q5至Q7(约70-85％)范围内的碱基调用精确度。其他SMS方法(例如，零模式波导测序；SMRT Pacific Biosciences)也具有高的错误率。

纳米孔和使用纳米孔测序的方法是本领域已知的。参见例如Clarke等人，2009，“Continuous base identification for single-molecule Nanoore DNA sequencing”，Nature Nanotechnology 4：265-70；Riehnet等人，2007，“Nanochannels for Genomic DNAAnalysis:The Long and the Short of It”，in Integrated Biochipsfor DNAAnalysis.Springer New York,151-186；Min et al.,2011,Fast DNA sequencing witha graphene-based nanochannel device.Nature Nanotechnology 6.3:162-65；美国专利No.6,673,615；No.7,258,838；No.7,238,485；No.7,189,503；No.6,627,067；No.6,464,842；和No.6,267,872；美国专利申请公开2008/0248561,2008/0171316,and 2008/0102504；以及国际专利申请公开No.WO 2014/096830，其各自通过引用并入本文。最常见的是，当平移通过纳米孔时，针对一条单链DNA确定序列。双链多核苷酸的两条链可以通过在双链分子的一端引入发夹环并顺序地测序连接的有义链和反义链来测序(参见WO 2013/014451)。已经提出了对平移通过纳米孔的双链DNA进行测序(参见，Wendell等人，2009，“Translocation of double-stranded DNA through membrane-adapted phi29motorprotein nanopores”Nature Nanotechnology4：765-72)。在某些方法中RNA被测序。