[发明专利]用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法

权利要求书

1.一种用于测定神经毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点；

其中，所述锚定蛋白是稳定地附着于或整合到质膜中并与神经毒素敏感细胞的细胞溶质接触的多肽，并且所述锚定蛋白选自膜蛋白、跨膜蛋白或整合膜蛋白、或膜相关蛋白；

(b)将(a)的神经毒素敏感细胞与神经毒素一起温育并在允许所述神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述神经毒素敏感细胞；

(c)将(b)的神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下透化；和

(d)量化从(c)的透化的神经毒素敏感细胞释放的所述报告蛋白的活性，

从而确定所述神经毒素的生物活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经毒素敏感细胞源自肿瘤细胞系、原代细胞、干细胞或诱导多能干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述锚定蛋白是选自胆碱转运蛋白、H1受体、G蛋白偶联受体(GPCR)和SV2的膜蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经毒素切割位点选自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT切割位点。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告蛋白是选自荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶(HRP)的酶或选自GFP、YFP、BFP和RFP的荧光蛋白。

6.根据权利要求1所述的方法，其中溶血素用于所述神经毒素敏感细胞的透化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶血素选自链球菌溶血素O、产气荚膜梭菌溶血素O、肺炎球菌溶血素、细菌溶血素和来自蛇或蜘蛛的成孔毒素。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包括选自胆碱转运蛋白-GFP-SNAP-25-荧光素酶、H1受体-SNAP-25-荧光素酶和H1受体-SNAP-25-HRP的融合蛋白。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告蛋白的活性的定量包括所述报告蛋白的活性的标准化。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述报告蛋白的活性的标准化是通过测定留在所述神经毒素敏感细胞中或所述神经毒素敏感细胞处的非切割融合蛋白的残余报告蛋白活性或者所述融合蛋白的总报告蛋白活性来进行的。

11.一种融合蛋白，其由(i)锚定蛋白、(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点组成，用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性；

其中，所述锚定蛋白是稳定地附着于或整合到质膜中并与神经毒素敏感细胞的细胞溶质接触的多肽，并且所述锚定蛋白选自膜蛋白、跨膜蛋白或整合膜蛋白、或膜相关蛋白。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述锚定蛋白选自胆碱转运蛋白、H1受体、G蛋白偶联受体(GPCR)和SV2；所述报告蛋白是选自荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶的酶或选自GFP、YFP、BFP和RFP的荧光蛋白；并且所述神经毒素切割位点选自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT切割位点。

13.根据权利要求11或12所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括选自胆碱转运蛋白-GFP-SNAP-25-荧光素酶、H1受体-SNAP-25-荧光素酶和H1受体-SNAP-25-HRP的融合蛋白。