[发明专利]用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法

说明书

本发明涉及一种用于测定神经毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点；(b)将(a)的神经毒素敏感细胞与神经毒素一起温育并在允许所述神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述细胞；(c)将(b)的神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下透化；和(d)量化从所述细胞释放的所述报告蛋白的活性，从而确定所述神经毒素的生物活性。此外，本发明涉及一种融合蛋白，其包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白，和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点，用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性。本发明还涵盖一种包含本发明的融合蛋白的试剂盒。最后，本发明涉及本发明的融合蛋白用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性的用途。

本发明涉及一种用于测定神经毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点；(b)将(a)的神经毒素敏感细胞与神经毒素一起温育并在允许所述神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述细胞；(c)将(b)的神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下透化；和(d)量化从所述细胞释放的所述报告蛋白的活性，从而确定所述神经毒素的生物活性。此外，本发明涉及一种融合蛋白，其包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白，和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点，用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性。本发明还涵盖一种包含本发明的融合蛋白的试剂盒。最后，本发明涉及本发明的融合蛋白用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性的用途。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生高效的神经毒素，即肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异性结合神经元细胞并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa单链蛋白。翻译后加工涉及二硫键的形成，和由细菌蛋白酶进行的有限的蛋白水解(切口)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链，其通过二硫键连接。CNT在结构上和功能上由三个结构域组成，即催化轻链、涵盖转位结构域的重链(N端半部)和受体结合域(C端半部)；参见例如Krieglstein 1990,《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》,188,39；Krieglstein 1991,《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》,202,41；Krieglstein 1994,《蛋白质化学杂志(J.Protein Chem.)》,13,49。肉毒杆菌神经毒素被合成为包含150kDa神经毒素蛋白和相关无毒蛋白的分子复合物。所述复合物大小根据梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围有300kDa，超过500kDa和900kDa。这些复合物中的无毒蛋白稳定神经毒素并保护其免于降解；参见Silberstein 2004,《疼痛实践(Pain Practice)》,4,S19-S26。

肉毒梭菌分泌七种抗原性不同的血清型，称为肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的A至G。所有血清型以及破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)都是通过切割SNARE蛋白来阻断突触胞吐作用的Zn²⁺内切蛋白酶；参见Couesnon,2006,《微生物学(Microbiology)》,152,759。CNT引起肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007,PNAS104,10447。