[发明专利]使用化学连接和半抗原转移的邻近测定法

说明书

用于原位检测两个目标靶标的邻近的方法，其特征在于与具有可检测部分的可切割桥组分缀合的抗体和与不可切割桥组分缀合的抗体。所述桥组分各自具有适于在特定条件下且当靶标密切邻近时形成共价键的化学连接基团。在共价键形成之后，所述可切割桥组分可以从抗体切割，有效地将所述可检测部分转移至所述不可切割桥组分。所述可检测部分的检测表明靶标密切邻近。所述方法与显色和荧光检测系统相容。所述方法可用于进行其中在同一载片上检测一个或多于一个邻近事件的测定。

发明领域

本发明涉及原位邻近测定法，具体而言使用邻近诱导的化学连接反应以形成共价键和随后转移可检测的半抗原的邻近测定法。本发明的特征还在于蛋白-蛋白相互作用、融合蛋白和蛋白翻译后修饰的检测。

发明背景

邻近测定法用于评价两个特定蛋白或其部分是否紧密邻近，例如彼此结合的蛋白，紧密邻近定位的融合蛋白和/或蛋白。一种被称为邻近连接测定法(PLA)的这种测定法的特征在于与目标靶标结合的两个抗体(在不同物种中产生)(参见Nature Methods 3,995-1000 (2006))。然后作为具有连接的独特寡核苷酸链的物种特异性二抗的PLA探针与适当的一抗结合。在靶标密切邻近的情况下，PLA探针的寡核苷酸链可与额外的ssDNA和DNA连接酶相互作用，使得它们可以经由滚环循环扩增(RCA)循环和扩增。当使用高度进行性的DNA聚合酶诸如Phi29 DNA聚合酶时，环状DNA模板可以复制长数百至数千倍，因此产生长度为几百纳米至微米的ssDNA分子(参见Angewandte Chemie International Edition,2008, 47, 6330-6337)。扩增后，可以经由检测系统检测复制的DNA。因此，可见信号表明目标靶标是紧密邻近的。这些测定法的特征在于使用几种DNA-抗体缀合物以及酶诸如DNA连接酶和DNA聚合酶。这些缀合物和酶可能是昂贵的，并且它们还需要严格的测定条件以便实现正常的功能和稳定性。此外，该方法生成扩增的DNA序列，尽管容易检测，但无法保持与所检测的邻近事件共定位。

用于研究蛋白-蛋白相互作用的另一种测定法包括双重结合剂(DB)测定法，其利用通过柔性接头连接的具有快速解离速率动力学的两个Fab片段组成的双特异性检测剂(Development of Bispecific Molecules for the In Situ Detection of Protein-Protein Interactions and Protein Phosphorylation, Chemistry & Biology 21, 1–12, March 20, 2014)。原则上，因为双重结合剂包含具有快速解离速率动力学的Fab片段，所以如果仅Fab片段之一与其表位结合，则洗掉双重结合剂(双重结合剂的两个Fab片段的同时协同结合防止双重结合剂的解离并导致阳性染色/可见性)。这些方法需要具体开发具有特异性结合动力学的fab片段，这使得将其实现至目标靶标的宽度不合理。

另一种方法，Grossman等人，描述了通过将报告基团从供体探针转移至附近的接受探针来检测邻近靶核酸的测定法。探针被设计成与靶核酸的互补区段相邻地退火。探针对的退火(密切邻近)允许发生反应(例如，硫基交换反应等)，这便于报告基团(例如荧光猝灭剂)的转移(参见Grossman等人, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7119-7122)。

根据另一种方法，PCT公开申请WO2014/139980(对于与邻近测定法和用于实现其的工具相关的公开内容，其以其整体通过引用并入本文)描述了生物素连接酶底物和酶用于进行邻近测定的用途。该方法提供了靶分子和邻近度的检测，同时维持样品的细胞环境。使用生物素连接酶诸如来自大肠杆菌的酶和用于该酶的肽底物诸如氨基酸底物提供了FFPE样品中的蛋白-蛋白相互作用的灵敏和特异性检测。因为生物素连接酶可以在生物素存在的情况下有效地生物素化适当的肽底物，并且仅当酶使得与肽底物物理接触时才可发生反应，所以生物素连接酶和底物可以分别与分别识别目标靶标的两种抗体缀合。