[发明专利]整合转基因的位点定向CRISPR/重组酶组合物和方法

权利要求书

1.一种多肽，其包含：

(i)能够结合向导RNA的失去催化能力的CRISPR-Cas结构域，其氨基酸序列是在SEQ IDNO:1上进行D10A突变和选自H840A、N854A、N863A和其组合的第二突变后获得的序列，其中所述向导RNA能够与靶DNA序列杂交；和

(ii)包含丝氨酸重组酶的重组酶结构域，其中所述重组酶结构域的氨基酸序列是SEQID NO:5或SEQ ID NO:5变体，所述SEQ ID NO:5变体中的突变为以下突变组合之一：(1)I77L，I3P和V108A；(2)I77L和L135R；(3)I77L，S12R和I103V；(4)I77L和E132A；(5)I77L，I3L和L135R；(6)I77L，I3S和E132A；或(7)I77L，N127H和E132A。

2.根据权利要求1所述的多肽，还包含连接CRISPR-Cas结构域和重组酶结构域的接头。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述接头具有苏氨酸-丝氨酸的氨基酸序列。

4.一种组合物，其包含权利要求1所述的多肽和向导RNA。

5.根据权利要求4所述的组合物，还包含供体DNA，所述供体DNA包含由所述丝氨酸重组酶识别的第一核苷酸序列和转基因。

6.一种组合物，其包含：

(i)编码权利要求1所述多肽的第一核苷酸序列；和

(ii)编码向导RNA的第二核苷酸序列；

其中所述第一和第二核苷酸位于相同或不同的载体上。

7.根据权利要求6所述的组合物，还包含供体DNA，所述供体DNA包含由所述丝氨酸重组酶识别的第一核苷酸序列和转基因。

8.根据权利要求6所述的组合物，还包含编码所述丝氨酸重组酶的第三核苷酸序列。

9.将转基因整合到细胞基因组中的非疾病诊断和治疗目的的方法，包括将权利要求6所述的组合物引入非人细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物还包含编码所述丝氨酸重组酶的第三核苷酸序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述非人细胞是真核细胞。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述非人细胞是哺乳动物细胞。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述非人细胞是单细胞胚胎。