[发明专利]整合转基因的位点定向CRISPR/重组酶组合物和方法

说明书

本申请公开了靶向的嵌合多肽、其组合物、表达载体及其使用方法，用于产生转基因细胞、组织、植物和动物。本发明的组合物、载体和方法也可用于基因治疗和细胞治疗技术。所述嵌合多肽包括CRISPR‑Cas结构域和重组酶结构域。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月5日提交的美国临时专利申请62/088,440的优先权，其公开内容在此参考并入。

发明领域

本发明通常涉及用于将转基因整合到细胞基因组中的组合物和方法。

背景技术

来源于成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统的RNA导向的Cas9核酸酶提供了用于编辑多种生物体的基因组的通用工具。然而，目前基于CRISPR-Cas系统的技术具有有限的插入大片段DNA的能力，并且无法在非分裂细胞(如神经元)或具有DNA同源重组缺陷的细胞中进行基于同源性的编辑，例如靶向转基因插入。因此，仍然需要新的基因组工程技术，所述技术可负担得起，易于建立并且能够在非分裂细胞或具有DNA同源重组缺陷的细胞中编辑基因组。

发明简述

本申请公开了靶向的嵌合多肽，包括其组合物、表达载体及其使用方法，用于产生转基因细胞、组织、植物和动物。本发明的组合物、载体和方法也可用于基因治疗和细胞治疗技术。

一方面，本公开涉及嵌合多肽。该多肽包括：1)CRISPR-Cas结构域和2)重组酶结构域。在各种实施方式中，CRISPR-Cas结构域能够结合向导RNA，其中所述向导RNA能够与靶DNA序列杂交，并且重组酶结构域包含位点特异性重组酶、其突变体或其片段。

在一些实施方式中，CRISPR-Cas结构域包含II型Cas9蛋白(SEQ ID NO：1)或其片段。在某些实施方式中，CRISPR-Cas结构域不具有核酸内切酶活性。在某些实施方式中，CRISPR-Cas结构域是失去催化能力的Cas9(dCas9)。在某些实施方式中，CRISPR-Cas结构域包含SEQ ID.1的氨基酸序列。

在一些实施方式中，重组酶结构域包含位点特异性重组酶。在一些实施方式中，位点特异性重组酶是酪氨酸重组酶。酪氨酸重组酶的实例包括但不限于Cre、Flp和λ整合酶。在一些实施方式中，位点特异性重组酶是丝氨酸重组酶。丝氨酸重组酶的实例包括γ-δ解离酶、Tn3解离酶(SEQ ID NO：2)、Sin解离酶、Gin转化酶、Hin转化酶、Tn5044解离酶、IS607转座酶和整合酶。在一些实施方式中，位点重组酶是选自Bxb1、wBeta、BL3、phiR4、A118、TG1、MR11、phi370、SPBc、TP901-1、phiRV、FC1、K38、phiBT1和phiC31(SEQ ID NO.3)的整合酶。

在某些实施方式中，重组酶结构域包含如上所述的位点特异性重组酶的突变型或片段。在某些实施方案中，突变体具有改变的靶特异性。在一些实施方式中，突变体具有降低的靶特异性。在某些实施方式中，重组酶结构域包含重组酶的活化突变体，包括但不限于Tn3的活化突变体和phiC31的活化突变体。在某些实施方式中，重组酶结构域是重组酶的活化突变体的催化结构域。在某些实施方式中，重组酶结构域包含Tn3的活化突变体的催化结构域。在某些实施方式中，重组酶结构域具有选自如表1所列的SEQ ID NO：5及其变体的氨基酸序列。

在某些实施方式中，多肽还包含连接CRISPR-Cas结构域和重组酶结构域的接头。在某些实施方式中，接头具有苏氨酸-丝氨酸的氨基酸序列。

另一方面，本申请公开了包含上文所公开的多肽和向导RNA的组合物。在某些实施方式中，组合物还包含供体DNA，所述供体DNA含有位点特异性重组酶识别的第一核苷酸序列和转基因。