[发明专利]蛋白质制造方法

说明书

本发明提供了用于制造蛋白质的新方法，特别是当所述蛋白质需要与另一分子偶联时。本发明还提供了用于工业规模蛋白质制造以获得例如用于治疗目的的蛋白质的方法。

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域。更具体地，本发明涉及纯化抗体和抗体片段的方法。

背景技术

在治疗学领域中，蛋白质和抗体及抗体衍生的分子的使用在不断地发生并且显示其重要性，并因此并行发展了对受控制造工艺的需求。治疗性蛋白质的商业化需要其的大量生产。为此，蛋白质经常在宿主细胞中表达，随后在其制备成可施用的形式之前进行回收和纯化。

取决于要表达的蛋白质，宿主细胞的选择可以是哺乳动物宿主细胞(通常是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞)或细菌宿主细胞。在第一种情况下，蛋白质通常被分泌到回收的培养物上清液中，然后处理该溶液以进行蛋白质纯化。

当宿主细胞是革兰氏阴性原核细胞时，常常优选的表达系统涉及新合成的蛋白质，其积聚在周质空间内并从周质空间分离出来。在这种情况下，一旦达到所需的蛋白质表达水平，就将该细胞收获和加工。然后通过使收获的细胞进行蛋白质提取方法来回收蛋白质，这涉及将蛋白质从周质释放到溶液中，随后除去细胞碎片和其它杂质。细胞收获到蛋白质释放的这些步骤通常包括在所谓的初级回收中。然后将所得的含蛋白质的溶液加工以进行蛋白质纯化。用于周质表达的优选革兰氏阴性原核细胞通常是大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)细胞。

从复杂混合物的蛋白质纯化根据靶蛋白质进行调整。在抗体和抗体衍生产物的情况下，纯化通常涉及经由色谱法的第一产物捕获步骤，其提供第一次纯化和显著浓度的产物。该第一步之后通常是一个或多个进一步的色谱步骤，其用于减少污染物诸如宿主细胞杂质、培养基、纯化过程相关的杂质和产物相关的杂质。

近年来，将不同的蛋白质(包括抗体和抗体衍生的片段)与具有特定功能的另一种分子偶联已经变得越来越普遍，这被应用于诊断和治疗用途，仅举几个例子，可以是将抗体靶向至特定的一组细胞，或者可以是抗体将药物靶向至其特定的作用位点，或者该分子可以被预定为增加抗体在动物体内的半衰期。后者对于抗原结合抗体片段易于从动物的循环系统中迅速清除的情况尤其如此。

不同的分子可以通过蛋白质中的反应性基团与蛋白质偶联，反应性基团可以天然存在于蛋白质中，或通过蛋白质工程人工引入。通常，用于与第二分子的蛋白质结合的有利反应性基团是存在于未配对半胱氨酸残基中的硫醇基团。在这个意义上，抗体铰链是用于位点特异性反应的常见区域，因为它们含有半胱氨酸残基，并且远离抗体的可能参与抗原结合的其它区域。例如，硫醇基团的与聚乙二醇(PEG)的反应或PEG化是众所周知的位点特异性PEG化方法，其中可以使用多种硫醇特异性试剂。