[发明专利]快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法

权利要求书

1.一种葡糖基胺的快速衍生化的方法，其包括以下步骤：

提供包含糖基化生物分子的生物样品；

使糖基化生物分子与酶接触以生产去糖基化混合物；

提供包含与极性非质子、非-亲核有机溶剂合并的标记试剂的试剂溶液；和

混合试剂溶液、去糖基化混合物和缓冲溶液以生产反应混合物，所述反应混合物具有标记试剂、释放的葡糖基胺、蛋白质性胺和衍生的葡糖基胺，其中衍生的葡糖基胺的得率在约80-约100%之间，伴有少于0.2摩尔%的量的过量标记的葡糖基胺。

2.权利要求1的方法，其还包括通过在线固相提取来分离衍生的葡糖基胺的步骤。

3.权利要求1的方法，其中极性非质子、非-亲核有机溶剂选自DMF、DMSO和乙腈。

4.权利要求3的方法，其中反应混合物中的DMF浓度是少于约20%-约30%体积或反应混合物中的DMSO的浓度是少于约30%-约50%。

5.权利要求1的方法，其中去糖基化混合物与试剂溶液以约2.5:约1的体积比混合。

6.权利要求1的方法，其中试剂溶液具有维持在约环境温度的温度。

7.权利要求1的方法，其还包括加入猝灭溶液至反应混合物中，其中猝灭溶液包含乙二胺和反应混合物的pH移至大于约10。

8.权利要求7的方法，其中乙二胺:水:乙腈的比例是约5:约5:约90体积。

9.权利要求7的方法，其中在去糖基化混合物与试剂溶液混合后约2-约10分钟，猝灭溶液被加入到反应混合物中。

10.权利要求1的方法，其还包括在酶与生物样品合并后，将缓冲溶液加入到样品中的步骤。

11.权利要求1的方法，其中酶是肽N-糖苷酶F。

12.权利要求1的方法，其中反应混合物包含约50-约1000的量的摩尔过量的标记试剂。

13.权利要求10的方法，其中缓冲溶液是HEPES或磷酸钠。

14. 权利要求13的方法，其中缓冲溶液具有约7.9-约8.2的pH和约5 mM-约50 mM之间的浓度。

15.一种分析糖基化生物分子的方法，其包括以下步骤：

提供含有糖基化生物分子的生物样品；

使该化合物与酶接触以生产包含去糖基化合物的去糖基化混合物；

提供与无水二甲基甲酰胺(DMF)混合的标记试剂的试剂溶液；和

混合去糖基化混合物与试剂溶液，其中去糖基化混合物与试剂溶液以2.5:1的体积比混合并产生反应混合物，其中反应混合物包含约50-约1000的量的摩尔过量的标记试剂、释放的葡糖基胺、蛋白质性胺和衍生的葡糖基胺；和

加入猝灭溶液至反应混合物中，其中反应混合物的pH移至约10或以上并得到约80-100体积%的量的衍生的葡糖基胺。

16.权利要求15的方法，其还包括分离衍生的葡糖基胺和检测衍生的葡糖基胺的步骤。

17.一种分析糖基化生物分子的方法，其包括以下步骤：

生产去糖基化混合物，其中糖基化生物分子已通过天然或合成酶或化学技术去糖基化；

提供包含在极性非质子、非-亲核有机溶剂中的标记试剂的试剂溶液；

混合试剂溶液与去糖基化混合物以产生反应混合物，反应混合物具有标记试剂和反应副产物，其中蛋白质物质尚未被耗尽；

加入HEPES至反应混合物中，其中衍生的葡糖基胺的得率为约80-100体积%的量；和

通过具有至少一种吸附剂的在线固相提取分离衍生的葡糖基胺；和

通过LC、MS、UV或SCFC单独或组合检测衍生的葡糖基胺，其中衍生的葡糖基胺的检测指示糖基化生物分子的存在和量。

18.权利要求17的方法，其还包括洗涤吸附剂以促使反应副产物的移除的步骤。