[发明专利]快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法

说明书

相关申请的交叉参照

本申请要求2014年10月30日提交的美国临时申请号62/072,747和2015年1月26日提交的美国临时申请号62/107,994的优先权，其全文通过引用结合到本文中。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

无。

联合研究协议的当事人名称

无。

背景

分析来自生物源的化合物的方法常常包括衍生化步骤，以在色谱分离后引进有利于检测的荧光团。虽然存在不同的衍生化策略，但长处理时间是一个有效地采用一旦获得的分析数据的严重因素。最近已开发出减少前置时间(lead time)的试剂和相关方法，特别是关于具有胺或氨基的化合物的分析。然而伯胺和羟基之间的期望的反应选择性常常不能实现。进而，标记化合物的得率则不能优化。此外，现有技术方法频繁地生成“过度标记的”化合物。而且，标记的(labeled)或加标签的(tagged)化合物在高有机溶剂中的溶解性可能是低的，这阻碍下游固相提取程序(“SPE”)，尤其是基于亲水相互作用色谱的那些。同样，现有技术分析通常需要化合物从生物源分离和/或在衍生化之前经历洗涤步骤，这产生额外的步骤并减慢分析程序。

因此，存在对分析化合物的方法的需求，其中衍生化步骤以高得率生产被选择性地标记的加标签化合物，且不引起生物样品的降解或过度-标记，以在标记化合物的随后的分析期间提供高的分辨率。

发明概述

一种分析糖基化生物分子的方法，其包括以下步骤：(a) 生产去糖基化混合物，其中糖基化生物分子已通过天然或合成酶或化学技术去糖基化；(b) 提供包含在极性非质子、非-亲核有机溶剂中的标记试剂的试剂溶液；(c) 在反应混合物中，以约2.5:约1的体积比混合去糖基化混合物与试剂溶液；和(d) 检测衍生的葡糖基胺。反应混合物含有相对于可修饰的胺的范围从约10-约2000的量的摩尔过量的标记试剂，并可包括释放的葡糖基胺、蛋白质性胺和衍生的葡糖基胺。所述步骤可有目的地进行，而不损耗蛋白质物质。然后衍生的葡糖基胺可用在线或离线SPE和/或其它分离方法从反应混合物分离，或不从反应混合物分离。任选地，猝灭溶液可加入到反应混合物中，以致反应混合物的pH移至高于10。衍生的葡糖基胺的得率可以是反应混合物的约80-约100摩尔%的量。衍生的葡糖基胺然后从反应混合物分离并通过色谱检测、荧光检测、质谱(“MS”)或紫外光(“UV”)检测和/或其组合检测。在一些实施方案中，所述方法还可包括使糖基化生物分子与酶接触以生产去糖基化混合物的步骤，或可通过其它酶或化学技术去糖基化。

在另一方面，葡糖基胺的快速衍生的方法也在本文中描述。在一些实施方案中，葡糖基胺的快速衍生的方法包括以下步骤：(1) 提供生物样品；(2) 合并生物样品与肽N-糖苷酶F以生产去糖基化混合物；(3) 提供包含与无水二甲基甲酰胺(DMF)合并的标记试剂的试剂溶液；和(4) 混合去糖基化混合物与试剂溶液，以生产包含标记试剂、释放的葡糖基胺、蛋白质性胺和衍生的葡糖基胺的反应混合物。所述反应混合物可具有相对于可修饰胺的约10-约1000的量的摩尔过量的标记试剂。对于一些实施方案，摩尔过量的其它范围也在本文中描述。

在所述方法中，有机溶剂在反应混合物中的浓度可以是约0-约50%。在一些实施方案中，有机溶剂在反应混合物中的范围可以是约10-约40%。在一些示例性实施方案中，有机溶剂在反应混合物中的范围可以是约20%-约30%体积。去糖基化混合物与试剂溶液以约9:1-约1:9的体积比混合。在示例性实施方案中，去糖基化混合物与试剂溶液以约2.5:约1的体积比混合，以产生具有约25-约30%的试剂溶液的反应混合物。在一些实施方案中，试剂溶液在反应混合物中的量是28.6%。试剂溶液可以是处于维持在约环境温度或少于环境温度-约4℃的温度下。缓冲溶液可加入去糖基化混合物中。缓冲溶液可以是磷酸钠或HEPES。或者，生物样品可以在缓冲溶液，例如HEPES中去糖基化，以用更少的步骤促进随后的衍生化反应。

任选地，猝灭溶液可加入到反应混合物中。猝灭溶液可包含乙二胺。乙二胺:水:乙腈的比例可以是约5:约5:约90体积。然后可在去糖基化混合物与试剂溶液混合后约2-约10分钟，将猝灭溶液加入到反应混合物中。反应混合物的pH可移至约大于10。