[发明专利]使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸扩增有效
| 申请号： | 201580072952.7 | 申请日： | 2015-11-10 |
| 公开（公告）号： | CN107109495B | 公开（公告）日： | 2021-12-24 |
| 发明（设计）人： | 杰弗里·G·曼德尔 | 申请（专利权）人： | 伊鲁米那股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6853 | 分类号： | C12Q1/6853;C12N15/90;C12N15/10;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人： | 陆扬;艾娟 |
| 地址： | 美国加利*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 使用 crispr cas 系统 多核苷酸 扩增 | ||
1.一种用于扩增靶双链核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供一种系统，所述系统具有：
成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR) RNA (crRNA)，以及
成簇的规律间隔的短回文重复相关(Cas)蛋白，
其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域，
其中所述系统为II型成簇的规律间隔的短回文重复-成簇的规律间隔的短回文重复相关系统，并且所述系统还包含反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA (tracrRNA)；
(b)使所述靶双链核酸与所述系统接触以形成复合物；
(c)使引物与所述靶双链核酸的第二链杂交，所述引物包含与所述靶双链核酸的第二链的区域互补的序列，以及
(d)使用聚合酶从所述引物延伸与所述靶双链核酸的第二链互补的核酸。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括重复步骤(a)至步骤(d)一次或更多次。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸被线性地扩增。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸被指数地扩增。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸为双链DNA (dsDNA)。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸为双链RNA (dsRNA)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA为包含与反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA多核苷酸融合的成簇的规律间隔的短回文重复RNA多核苷酸的多核苷酸。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸的第一链包含与5’-NGG前间区相邻基序(PAM)互补的序列。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸的第一链包含通用序列，并且其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述通用序列的区域互补的序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述引物包含所述通用序列的区域的序列。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述通用序列具有SEQ ID No.3的序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含SEQ IDNo.7的序列。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID No.5的序列。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述通用序列具有SEQ ID No.4的序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含SEQ IDNo.8的序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID No.6的序列。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复相关蛋白为Cas9蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含两个失活的核酸酶结构域。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述两个失活的核酸酶结构域包含切割与所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA互补的链的结构域中的第一突变以及切割与所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA不互补的链的结构域中的第二突变。
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