[发明专利]使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸扩增

说明书

一种用于扩增靶核酸的方法，所述方法包括提供一种系统，所述系统具有crRNA或其衍生物以及Cas蛋白或其变体。所述crRNA或其衍生物包含与所述靶核酸的区域基本上互补的靶特异性核苷酸区域，并使所述靶核酸与所述系统接触以形成复合物。

本公开内容大体涉及用于扩增多核苷酸的方法，且更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统扩增多核苷酸的方法及其应用。

背景

核酸扩增为许多基于核酸的方法诸如核酸测序的关键步骤。目前，使用的大多数核酸扩增方法，例如在下一代测序中用于簇产生的那些，都需要温度循环和流体交换两者。在另一方面，等温扩增可以通过消除温度斜坡(temperature ramp)和平衡时间而是时间和能量有效的。已经开发了几种等温扩增方法，例如基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的等温扩增。这些等温扩增系统通常缺乏理想地适于一些应用的期望的速度和效率。此外，一些系统要求另外的酶和试剂，包括ATP。因此，本领域对方便、快速和有效的等温核酸扩增方法仍存在需求。本公开内容通过提供使用CRISPR-Cas系统扩增核酸的方法来解决该需求。还提供了相关优势。

成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)(CRISPR)牵涉许多细菌和古生菌(archaea)中保护细胞免受噬菌体和结合型质粒(conjugative plasmid)影响的干扰途径(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat Rev Genet.11(3):181-190)。CRISPR由通常起源于噬菌体或质粒DNA的相似尺寸的称作间隔子的独特可变DNA序列间隔的短重复序列的阵列组成(Barrangou等，2007,Science315:1709-12；Bolotin等，2005,Microbiology 151:2551-61；Mojica等，2005,J Mol Evol60:174-82)。因此，CRISPR序列提供过去的感染的适应性遗传记录，并且可以被转录为CRISPR RNA(crRNA)-靶向侵入性核酸的小RNA(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat RevGenet11(3):181-190)。CRISPR通常与编码与CRISPR相关蛋白的CRISPR相关(Cas)基因缔合。Cas蛋白可以提供破坏被crRNA靶向的入侵外来核酸的机制。CRISPR连同Cas(CRISPR相关)基因一起构成提供针对细菌和古生菌的侵入性外来核酸的获得性耐受性的适应性免疫系统(Barrangou等，2007,Science315:1709-12)。

概述

本公开内容提供了用于扩增多核苷酸的方法，且更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统扩增靶DNA序列的方法及其应用。

在一方面，本文提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法，所述方法包括：(a)提供一种系统，所述系统具有：成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体，其中crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域；(b)使靶双链核酸与系统接触以形成复合物；(c)使引物与靶双链核酸的第二链杂交，所述引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列，以及(d)使用聚合酶从引物延伸与靶双链核酸的第二链互补的核酸。

在一些实施方案中，本文提供的方法还包括重复步骤(c)至步骤(d)一次或更多次，例如，直至达到期望的扩增程度。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括重复步骤(a)至步骤(d)直至达到期望的扩增程度。

在一些实施方案中，本文提供的靶核酸为双链DNA(dsDNA)。在一些实施方案中，靶核酸为双链RNA(dsRNA)。

在一些实施方案中，系统为I型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中，系统为II型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中，系统为III型CRISPR-Cas系统或其衍生物。