[发明专利]用于生产冷杉醇的方法

说明书

本公开涉及通过在II类二萜合酶和双功能I/II类冷杉醇合酶的组合存在的情况下，将香叶基香叶基二磷酸(GGPP)转化为冷杉醇来生产冷杉醇的新方法、表达载体和宿主细胞。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月9日提交的美国临时专利申请No.62/089,511的申请日的优先权和权益，其公开内容通过引用并入本文。

发明领域

本公开的实施方式涉及生产冷杉醇的新方法以及在这种方法中有用的表达载体和宿主细胞。

发明背景

随着不断增长的世界经济和对更高生活水平的要求，对香料的需求也在增加。然而，由于自然资源和动物保护的限制，动物或植物基香料的供应有限。已尝试由可再生资源(例如微生物)生产香料或其前体。

龙涎香是珍贵的传统香料成分，是鲸肠的副产物。降龙涎香醚(Ambrox)是龙涎香的替代物，其是通过二萜香紫苏醇的化学转化生产的，二萜香紫苏醇目前是从快乐鼠尾草(clary sage)获得的。降龙涎香醚也可以由在冷杉和烟草中发现的相关二萜冷杉醇生成(Barrero等人，1993，Tetrahedron 49：10405-10412)。参见图1。

人们提出植物中朝向冷杉醇和香紫苏醇二者的通路均包括两个步骤。第一步由以下组成：通过II类二萜合酶(diTPS)的活性将类异戊二烯通路分子香叶基香叶基二磷酸(GGPP)转化为名为赖百当-13-烯-8-醇二磷酸(labda-13-en-8-ol diphosphate，LDPP)的常用中间体。第二步由I类diTPS催化。存在几种类型的I类diTPS，每种类型负责生产特定的最终产物。例如，冷杉醇合酶(ABS)用于冷杉醇生产，香紫苏醇合酶(Scs)负责香紫苏醇生产。参见图2。

参与GGPP朝向香紫苏醇或GGPP朝向冷杉醇的两步转化的酶是植物特异性的，并且可以呈两种独立的酶或具有两个活性位点的单一酶的形式。例如，在通过烟草的冷杉醇生产中(Sallaud等人，2012,Plant J.,72(1):1-17)，烟草的II类diTPS(被Sallaud等人称为NtCPS2，被本公开称为Nt-II类-diTPS)和烟草的I类diTPS合酶(被本公开称为烟草的冷杉醇合酶或Nt-ABS)呈两种不同蛋白质分子的形式。类似地，在通过快乐鼠尾草的香紫苏醇生产中(Schalk等人，2012,Journal of Am.Chem Soc.134:18900-18903)；(Caniard等人，2012,BMC Plant Biology 12:119)，快乐鼠尾草的II类diTPS(被Schalk等人称为Ss LPS，被本公开称为Ss-II类-diTPS)和快乐鼠尾草的I类diTPS合酶(被本公开称为快乐鼠尾草的冷杉醇合酶或Ss-Scs)也呈两种独立蛋白质分子的形式。相比之下，在通过冷杉的冷杉醇生产中(Zerbe等人，2012,J.Biol.Chem.287:12121-12131)，I类diTPS和II类diTPS的亚基都位于一个双功能I/II类冷杉醇合酶上(被Zerbe等人和本公开称为AbCAS)。因此在冷杉中，GGPP在单一双功能I/II类冷杉醇合酶存在的情况下被转化为冷杉醇。参见图2。

香紫苏醇和冷杉醇的植物来源被认为是不能依赖的；因此，任一产品的微生物生产方法都具有商业价值。已经分离并在E.coli中同时表达了来自快乐鼠尾草的II类diTPS和香紫苏醇合酶基因，在实验室规模的发酵罐中产生了滴度为约1.5克/升的香紫苏醇。通过同时表达烟草的II类diTPS和冷杉醇合酶基因，或者表达冷杉的单独I/II类冷杉醇合酶，已经实现了冷杉醇在E.coli中的可测量生产。但是，基于现有方法的冷杉醇生产量非常低。因此可期望以高得多的滴度生产冷杉醇。

发明概述