[发明专利]干细胞材料及制备方法

说明书

技术领域

与本发明实施例一致的组合物和方法通常至少涉及细胞生物学、分子生物学和医学领域。更具体地说，本发明实施例涉及干细胞、干细胞条件培养基、获得干细胞条件培养基的方法以及干细胞和干细胞条件培养基的用途。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是可能分化为间充质细胞类型(例如，脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞)的多潜能基质细胞。MSC具有很强的自我更新能力，同时保持其多潜能性。骨髓MSC目前正在临床试验中应用于各种治疗。分离、纯化和复制培养物中的MSC的方法在本领域中是众所周知的。

可以使用磁珠，在单层(即二维)或三维系统中培养MSC。这些标准方法可以使MSC在与其生理环境极为相似的条件下生长。已证明MSC行为在体内和体外环境中可能不同。不同MSC细胞系之间的差异通常可归因于分离技术和体外培养条件的差异。例如，生长条件的变化可影响体外细胞行为，包括影响细胞表面标志物的表达。细胞表面特异性标志物的表达可用于区分不同细胞系或确认细胞系的谱系。

所有细胞(包括MSC)在培养过程中可产生生物制品。例如，已知MCS在培养过程中产生超过200种独特的蛋白质。MSC在培养过程中产生的特定生物制品可用于表征和区分不同MSC。然而，即使使用相同来源的MSC，分离技术和体外培养条件的差异也可影响和改变分泌生物制品的产生。当然，还知道偏离理想的细胞生长条件可能导致培养物的衰老和损失。

发明内容

根据本发明的其中一个方面，提供了一种来自Wistar大鼠的骨髓的独特的间充质干细胞系，其具有一个或多个特定特征。例如，当将0.7×10⁶个细胞接种到75cm²培养瓶中并培养至少96小时时，间充质干细胞系可以：(a)在更换培养基后24小时内，产生至少4.5mM乳酸盐；(b)在更换培养基后24小时内，产生至少150pg/ml的GRO/KC；(c)在更换培养基后24小时后，产生低于250pg/ml的OPG；或者(d)在更换培养基后24小时后，产生低于80pg/ml的TGF-β3。根据本发明的另一个方面，当将0.7×10⁶个细胞接种到75cm²培养瓶中并培养至少150小时时：(e)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值降至7.0以下；或者(f)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值与不含细胞的培养基的pH值相比下降至少0.4个单位。培养基可以是补充有5％CO₂的RPMI-1640培养基。此外，相同干细胞系在pH值低于7.05时，至少能进行一次群体倍增。干细胞系的特征还表现为CD29和CD44标志物的表达呈阳性以及CD11b和CD45标志物的表达呈阴性。

本发明的一个单独方面涉及一种条件培养基，该培养基可以通过将培养基中的多个独特干细胞保持在特定的调节期进行制备。一方面，培养基是补充有5％CO₂的RPMI-1640。细胞可以在各种条件(包括大气中的CO₂浓度或缺氧条件下)下保持在培养基中。根据本发明的该方面，调节期可能不同。例如，调节期可以为至少12小时，也可以为足以使条件培养基含有至少150pg/mL GRO/KC的时间段。在本发明的另外一个方面中，条件培养基可以至少包含以下一种产物：(a)至少500pg/mL的GRO/KC；(b)至少4000pg/ml的VEGF；(c)低于250pg/ml的OPG；或者(d)低于80pg/ml的TGF-β3。

本发明的另外一个方面涉及一种包含独特干细胞系或由独特细胞调节的培养基的组合物。组合物还可以包括合适的载体。载体可以包括液体、乳膏剂、气雾剂、洗剂、软膏剂、水凝胶，但并不限于此。在本发明的某些方面，可以对组合物进行处理，以除去部分或全部干细胞。在另外一个方面，组合物可以包含低于250pg/mL OPG或低于80pg/ml TGF-β3的条件培养基。

根据本发明的各个方面，独特的干细胞系、条件培养基或组合物可以通过注射、植入或通过局部应用给予受试者。根据本发明的其他方面，可将细胞、条件培养基或组合物应用于缝线、绷带、针织网、植入物、支架、移植物、湿巾、牙周垫或其他给药器械。细胞、条件培养基或组合物具有多种用途，包括，例如烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗，或用于治疗人或动物的其他疾病。

附图说明