[发明专利]使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法

权利要求书

1.一种富集样品的目的序列方法，包括：

a.提供从样品中提取的核酸，其中所提取的核酸包含目的序列和被靶向以待消减的序列，其中所述目的序列占所述样品的少于30％；

b.将所述提取的核酸片段化；

c.将所述目的序列和被靶向以待消减的序列连接至接头，且其中所述接头连接至所述目的序列和被靶向以待消减的序列的5’和3’两端，且其中所述目的序列和被靶向以待消减的序列为DNA；

d.使所述样品与多个CRISPR/Cas系统蛋白-gRNA复合物接触，其中所述gRNA与被靶向以待消减的序列互补，并由此切割靶向序列，生成仅在5’或3’端之一连接接头的被靶向以待消减的序列，以及在5’和3’端均连接接头的目的序列；和

e.使用接头特异性PCR扩增所述目的序列，从而富集未切割的目的序列的样品。

2.权利要求1的方法，其特征在于，所述样品包含被靶向以待消减的宿主核酸序列和目的非宿主核酸序列。

3.权利要求1或2的方法，其中通过大小排阻或通过使用生物素去除所述切割的靶向序列。

4.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括用至少10²个CRISPR/Cas系统蛋白-gRNA复合物与所述样品接触。

5.权利要求1或2的方法，其中所述样品是生物样品、临床样品、法医样品或环境样品的任一种。

6.权利要求2的方法，其中所述非宿主核酸序列包括微生物核酸序列。

7.权利要求6的方法，其中所述微生物核酸序列是细菌、病毒或真核寄生核酸序列。

8.权利要求1或2的方法，其中使所述样品与CRISPR/Cas系统蛋白-gRNA复合物接触，其中所述gRNA与线粒体DNA互补。

9.权利要求1或2的方法，其中使所述样品与CRISPR/Cas系统蛋白-gRNA复合物接触，其中所述gRNA与核糖体RNA序列对应的DNA、编码球蛋白的序列、编码转座子的序列、编码逆转录病毒序列的序列、包含端粒序列的序列、包含亚端粒重复的序列、包含着丝粒序列的序列、包含内含子序列的序列、包含Alu重复的序列、包含SINE重复的序列、包含LINE重复的序列、包含双核酸重复的序列、包含三核酸重复的序列、包括四核酸重复的序列、包含多聚A重复的序列、包含多聚T重复的序列、包含多聚C重复的序列、包含多聚G重复的序列、包含富含AT序列的序列、或包含富含GC序列的序列是互补的。

10.权利要求1或2的方法，其中所述提取的核酸包括单链DNA，双链DNA，单链RNA，双链RNA，人工DNA和DNA/RNA杂交体的任一种。

11.权利要求1或2的方法，其中所述提取的核酸包括cDNA或合成DNA。

12.权利要求1或2的方法，其中所述目的序列占所提取的序列的少于10％。

13.权利要求1或2的方法，其中所述CRISPR/Cas系统蛋白是Cas9。

14.权利要求1或2的方法，其中所述CRISPR/Cas系统蛋白是CRISPR/Cas系统蛋白切口酶。

15.权利要求14的方法，其中所述CRISPR/Cas系统蛋白切口酶是Cas9切口酶。

16.权利要求1或2的方法，其中所述CRISPR/Cas系统蛋白是热稳定的。

17.权利要求1或2的方法，其还包括用核酸外切酶III来处理步骤(d)的产物，其中所述接头呈Y形。