[发明专利]使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法

说明书

本文提供了用于从样品消减靶向的核酸序列、从样品富集目的序列和/或从样品分割序列的方法和组合物。在一个方面，本文提供了富集样品的目的序列的方法，包括：(a)提供包含目的序列和被靶向以待消减的序列的样品，其中所述目的序列占样品的少于30％；(b)将样品与多个CRISPR/Cas系统蛋白‑gRNA复合物接触，其中所述gRNA与靶向序列互补，并由此切割靶向序列。在本文公开的一个实施方案中，该方法进一步包括从样品提取目的序列和被靶向以待消减的序列。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月20日提交的美国临时申请序列号No.62/094,980和2015年7月28日提交的美国临时申请序列号No.62/198,097的优先权。这些申请的内容通过提述以其整体并入本文。

发明背景

许多人临床DNA样品或样品文库(如源自RNA的cDNA文库)或从组织，流体或其他宿主材料样品提取的DNA样品含有高度丰富的序列，其信息价值很小且增加了测序成本。虽然已经开发了消减(deplete)这些序列的方法(例如通过杂交捕获)，但是这些方法通常是耗时的并且可能是低效的。此外，杂交捕获通常寻求捕获DNA目的序列，同时丢弃剩余的序列。因此，当DNA目的序列预先未知时(例如当筛选样品以研究所有微生物或非宿主DNA序列时)，通过杂交捕获的消减不是可行的选择。

尽管可以进行人样品的鸟枪法测序来研究微生物DNA，但是由于成本，许多样品中微生物DNA的低水平排除了许多复杂和/或目的样品的鸟枪法测序。这是实情，例如，对于样品的宏基因组分析，其中样品含有多于一个物种的生物体(真核生物，原核生物或病毒生物体)。例如，源自全血的DNA文库通常含有99％的人DNA。因此，为了从鸟枪法测序检测人血液中循环的感染原，需要测序到非常高的覆盖范围以确保足够的覆盖。因此与测序高人类DNA样品相关的大量成本提供了相对少的宏基因组数据。因此，许多人组织DNA样品被认为不适合进行宏基因组测序只是因为数据产量与所需资源相比是较低的。因此，本领域需要增加高宿主DNA样品中的微生物DNA产量，特别是当测量高宿主内源性(HHE)DNA样品时，增加待测序的微生物DNA的百分比。

DNA提取的近期进展提供了一些测序技术，从而指出宏基因组学领域的重点从PCR扩增的16S核糖体RNA标记转到整个宏基因组的鸟枪法测序。然而，由于在整体样品材料中微生物DNA的百分比较低，因此在对HHE DNA样品进行测序时，鸟枪法测序可能产生不理想的结果。此外，鸟枪法测序通常不能提供足够的信息以在宏基因组分析中达到准确的分辨率，特别是当所选择的分子(例如16S核糖体RNA)仅代表单一谱系(lineage)时。此外，16S核糖体RNA谱系通常不能区分病原体与密切相关的细菌的非致病菌株，而这是临床宏基因组分析的关键目标。

相反，对于宏基因组分析而言使用全基因组DNA和RNA序列是优选的，因为它提供了整个宏基因组的信息。因此，本领域需要提供用于宏基因组分析的DNA和RNA测序技术以得到改进的分辨率。例如，肥胖和正常体重患者的粪便材料的宏基因组的全基因组分析揭示了微生物群落结构的高度可重复的差异。这些材料往往具有非常高的微生物DNA含量(99％的微生物和1％的人)。

相比之下，源自许多其他组织(包括人血液，阴道，鼻粘膜和肺)的测序文库通常含有90％的人DNA和10％的微生物DNA。虽然具有10％微生物DNA的样品仍然可以通过足够的测序获得足够的信息用于宏基因组分析，但是用较少目标DNA的标本测序所需的量是昂贵的，因此对于许多研究人员而言是不能维持的。

因此，本领域中需要得到用于宏基因组分析的低成本、有效的方法和组合物。本文提供了这些方法和组合物。

本文引用的所有专利，专利申请，出版物，文献，网络链接和论文均通过体术以其整体并入本文。

发明简述