[发明专利]使用二代测序预测器官移植排斥的方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种通过测定获自器官移植受体的生物样品中的供体特异性核酸序列和受体特异性核酸序列之间的比率非侵入性预测器官移植排斥的方法，更具体地，涉及一种基于通过分析获自器官移植受体的生物样品(例如血液)测定源于供体的标志物序列和源于受体的标志序列之间的比率的结果预测器官移植排斥的方法。

背景技术

准确及时诊断器官移植受体中的器官移植排斥对于器官移植受体的存活来说是必需的。然而，目前所使用的诊断器官移植排斥的方法具有许多缺陷。例如，用于诊断心脏移植排斥的黄金标准是使用心脏活检手术在各时间点检查组织，然而，此方法显示许多问题，包括高成本，组织活检医生之间的差异性，以及严重的患者不适(F.Saraiva等，Transplant.Proc.卷43，第1908-1912页，2011)。

为了克服这些缺陷，已经使用非侵入性方法，诸如，当发生器官移植排斥时测定基因表达信号的方法，测定免疫蛋白水平的方法，等等。然而，由于不同免疫反应的复杂交叉反应而倾向于产生高假阳性结果，并且基于组织特异性基因表达信号，这些方法也有局限性。

在九十年代末，在器官移植受体的尿液和血液中检测到源于供体的无细胞DNA(cfdDNA)(J.Zhang等，Clin.CHem.卷45,第1741-1746页,1999.,Y.M.Lo等，Lancet,卷351,第1329-1330页,1998)。基于此发现，已经推荐器官移植排斥的非侵入性诊断方法。例如，可使用检测Y染色体的多种分子和化学检测分析具有来自雄性供体器官的雌性受体中的供体特异性DNA(T.K.Sigdel等，Transplantation,卷96,第97-101页,2013)。然而，cfdDNA微量存在，而背景DNA则大量存在。因此，需要用于分析此cfdDNA的高特异性和敏感的方法。

二代测序(NGS)能够克服这些限制，并且越来越普及。不像现有的方法，二代测序技术能够在短时间跨度内产生大量数据。因此，对于个人基因组测序来说，此方法具有时间和成本有效性。二代测序还提供了检测孟德尔疾病、罕见病、癌症等疾病中的致病基因的史无前例的机会。在基因组测序平台方面已取得巨大进步，并且逐渐减少测序数据分析成本。在二代测序技术中，从样品提取DNA并进行机械片段化，之后进行尺寸特异性文库构建，用于测序。当通过使用高通量测序系统重复带有一个碱基单元的四种互补核苷酸的缔合和解离时，产生起始测序数据。接下来，进行基于生物信息学的分析，其包括起始数据修整、绘制图谱、基因突变鉴定、以及突变注释。此分析使得鉴定可影响疾病和多种生物表型的基因突变。因此，通过新治疗剂的开发和商业化，二代测序技术有助于产生新的附加值。二代测序技术不仅可用于DNA分析，还可用于RNA和甲基化分析。这包括全外显子组测序(WES)，其仅对于编码蛋白质的外显子组区进行捕获和测序。此全外显子组测序技术是一种产生与疾病发生具有最直接关联的蛋白质的编码区序列的方法。此技术被广泛使用，这是因为与全基因组测序相比，仅外显子组区的测序更具有成本有效性。全外显子组测序技术的修饰通常被称为靶向测序。此测序技术具有通过使用设计的探针检测感兴趣的区域中的基因突变的能力。所述探针仅捕获感兴趣的基因区，这又转而用于检测感兴趣的主要基因中的基因突变。此技术相对容易实施，能够以显著较低的成本实现。此测序技术被称为靶向测序。

使用此二代测序技术使得能够分析样品中存在的所有核酸，由此对于分析以非常低浓度存在于所需样品中的cfdDNA来说非常有用，这是众所周知的事实。例如，Iwijin De Vlaminck等对于随时间从65名心脏移植患者获得的565份样品进行了分析，显示当出现器官移植排斥时来自受体的样品的cfdDNA水平升高(Iwijin De Vlaminck等，Sci.Transl.Med.卷6,241ra77,2014)。

然而，此方法具有局限性，由于其分析全基因组数据需要大量的时间和成本。

因此，本发明的发明人进行了多方面的努力以解决上述问题，结果发现当下列表1至10中所示的标志物被扩增至小于200bp的尺寸并用于二代测序时，样品中的cfDNA可以完整使用，同时保持分析敏感性和准确性，分析时间和成本显著降低，由此实现了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供通过二代测序(NGS)或数字碱基扩增来预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法。