[发明专利]cTnⅠ主要表位区的重组表达及其抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及人肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的三个主要表位区的重 组表达及其相应抗体的制备方法。

背景技术

急性心肌梗塞（AMI）是临床常见急性多发病，是威胁人类生命的主要疾病之一。在 AMI生化诊断指标方面，肌酸激酶同工酶（CK-MB）一度被认为是诊断的“金标准”，但CK-MB非 心脏特有，非心脏手术或骨骼肌损伤病人也常出现CK-MB增高，造成AMI诊断假阳性。近年来 的研究表明，人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiactroponinⅠ,cTnⅠ)具有高度心肌特异性，当心肌细 胞受损时，血液中的cTnⅠ出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，可作 为心肌损伤诊断的一项特异性指标，正逐步取代CK-MB成为判断心肌损伤的新的特异性标 准物。

肌钙蛋白（Troponin，Tn）由肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）、肌钙蛋白C（TnC）和肌钙蛋白T(TnT) 三个亚单位组成。TnⅠ有三种亚型：快型骨骼肌亚型，慢型骨骼肌亚型和心肌亚型。心肌肌钙 蛋白Ⅰ（cTnⅠ）在心肌组织中表达，在骨骼肌中不表达，具有心肌的高度特异性。正常情况下 cTnⅠ与TnT和TnC结合，以三元复合物的形式存在，AMI后cTnⅠ释放入血，其在血清中大部分 以复合物的形式存在，其中4.1%为游离型，还可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋 白降解片段等多种形式存在。

cTnⅠ共有210个氨基酸，含2个半胱氨酸，原核表达系统中表达的重组蛋白均为包 涵体，较难复性，且复性后的蛋白易被蛋白酶降解，难以保存。目前cTnⅠ蛋白主要从人心肌 组织提取，来源有限，成本昂贵，很难大量制备，所以表达高免疫原性的人cTnⅠ蛋白，并制备 其特异性抗体具有很好的市场前景。

发明内容

本发明公开了一种cTnⅠ主要表位区的重组表达方法。根据cTnⅠ表位图谱和蛋白结 构，本发明选取了位于cTnⅠ的N端、C端和中间稳定区的三个表位区，在大肠杆菌表达系统中 均获得可溶性表达。本发明还公开了使用三种重组蛋白制备cTnⅠ单克隆抗体、多抗血清的 方法。

附图说明

图1是本发明制备人cTnⅠ主要表位区重组蛋白的流程示意图；

图2是本发明制备重组cTnⅠ主要表位区的SDS-PAGE电泳图：

1、Ni²⁺螯合亲和柱纯化cTnⅠ-N融合蛋白；

2、Ni²⁺螯合亲和柱纯化cTnⅠ-S融合蛋白；

3、Ni²⁺螯合亲和柱纯化cTnⅠ-C融合蛋白；

4、酶切纯化后cTnⅠ-N蛋白；

5、酶切纯化后cTnⅠ-S蛋白；

6、酶切纯化后cTnⅠ-C蛋白；

7、TF蛋白；

图3是使用本发明的方法获得的重组cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白免疫原性的检测；

图4是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C偶联载体蛋白后，免 疫兔子，对所制备的多抗血清进行效价检测；

图5是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C免疫小鼠，对所制备 单抗腹水进行效价检测。

具体实施方式

实施例1：cTnⅠ-N编码序列的扩增

cTnⅠ-N包含了全长cTnⅠN端的特征性表位区。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnⅠ（由南京 金斯瑞公司合成cTnⅠ编码序列所构建的重组质粒）扩增出cTnⅠN端1-79位氨基酸的编码序 列，所用的引物N5的5’端添加了NdeⅠ的酶切位点，引物N3的3’端添加了XbaⅠ的酶切位点

cTnN5：5’-aagcatatggccgatggttcttccgatg-3’

cTnN3:5’-aagtctagagcaacgcgtgctcagtgc-3’