[发明专利]一种植酸酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列SEQ IDNO：1,是由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发 生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R, Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q而获得的；所述植 酸酶突变体的核苷酸序列SEQIDNO：2。

2.一种如权利要求1所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。

3.一种如权利要求1所述植酸酶突变体的获得方法，其特征在于，所述植 酸酶突变体的获得方法包括：

无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，分别设计下列 引物进行突变PCR扩增；PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；

取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确后加1μlDMT酶 于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；

然后转化，加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中，轻弹 混匀，冰浴30分钟；42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB 培养基，200转，37℃培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留 100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；

验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对， 找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至 止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或X33、SMD1168、 PICHIAPINK中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。

4.如权利要求3所述的植酸酶突变体基因工程菌的获得方法，其特征在于， 所述植酸酶基因突变体与PPIC9、PPICZaA/B/C、PPICZA/B/C、PGAPZaA/B/C、 PICHIAPINK-Hc、PICHIAPINK-Lc的表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌 GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中，通过在平板上加入植酸钙或在平 板中加入G418、Zeocin抗生素，筛选获得植酸酶突变体基因工程菌，然后通过 发酵获得新的植酸酶突变体。

5.如权利要求3所述的植酸酶突变体酶学特性是，其特征在于，所述植酸 酶突变体的酶促反应pH值为6.0；温度为50℃；在pH2、37℃条件下，pH耐受 1小时，残活还在60％，在pH5、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在90％ 以上；植酸酶在70℃耐受5min、80℃时耐受3min、高温90℃时耐受1min，残 活都在80％以上。