[发明专利]一种植酸酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种植酸酶突变体及其应用。

背景技术

植酸广泛存在于玉米、米糠、各种饼粕等饲料原料中，一方面它具有很强 的抗营养作用，与饲料中金属离子和蛋白质结合，影响这些营养物质的消化与 吸收；另一方面植酸分子含有大量有机磷，动物胃肠道由于缺少相应的酶，因 而不能利用，这些有机磷随粪便排放到环境中，造成环境污染。植酸酶可使植 酸发生水解反应，生成肌醇衍生物和正磷酸，作为单胃动物的饲料添加剂，可 以促进动物对磷元素的利用，有助于畜禽生长，提高畜牧业效益，同时它还能 降低植酸磷对环境的污染，并且可以提高饲料中能量与蛋白质的消化率。现在 已成为饲料行业公认的有效饲料添加剂。植酸酶作为饲料添加剂在实际应用过 程中需要耐受饲料高温制粒过程，因此饲用植酸酶必须耐热，而目前大多数植 酸酶耐热性能较差。

无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)虽然酶比活相对高，也具有一定的耐热作 用，但在实际应用上还不理想，如果能够将其耐热性增高，无花果植酸酶将具 有更大的应用价值。相比之下，烟曲霉植酸酶有着更好的耐热性，但比活相对 较低。因此，本发明根据烟曲霉植酸酶的序列中与其耐热性相关的氨基酸序列 来改造无花果曲霉植酸酶，使其成为耐热性高的植酸酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植酸酶突变体及其应用，旨在解决无花果植酸 酶的耐热性较差，在实际应用上不理想的问题。

本发明是这样实现的，通过定点突变的方法将编码无花果曲霉(黑曲霉) 植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L, V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S, V255D,D256A,T257S,K258Q获得一种新的植酸酶突变体，所述植酸酶突变体 的氨基酸序列SEQIDNO：1；所述植酸酶突变体的核苷酸序列SEQIDNO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应 用。

本发明的另一目的在于提供一种如所述植酸酶突变体的获得方法，所述植 酸酶突变体的获得方法包括：

原来无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变 PCR扩增；PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；

取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加1μlDMT酶 于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；

然后转化，加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中，轻弹 混匀，冰浴30分钟；42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB 培养基，200转，37℃培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留 100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；

验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对， 找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至 止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、 PICHIAPINK)中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。

进一步，所述PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，66℃ 退火30S，72℃延伸3min30S，共28个循环；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃ 延伸3min30S，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个 循环温度下降0.5℃。

进一步，所述植酸酶突变体的酶促反应最适pH值为6.0；最适温度为50℃； 在pH2、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在60％左右，在pH5、37℃条件 下，pH耐受1小时，残活还在90％以上。植酸酶在70℃耐受5min、80℃时耐 受3min、高温90℃时耐受1min,残活都在80％以上。