[发明专利]一种检测黄牛Leptin基因单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛Leptin基因第12265位单核苷酸多态性 的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而 引起的多态性，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。 在二倍体生物群体中，SNPs理论上可由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等 位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被称为二等位基因分子标记。根据SNPs在基因组中分布 的位置，又可划分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs) 等类型。其中，cSNP造成的影响较大，又可分为两种类型：同义cSNPs和反义cSNPs。同义 cSNPs不改变氨基酸的序列，通常通过影响mRNA的稳定性或密码子的偏好性改变基因的转 录效率；反义cSNPs则可导致氨基酸序列发生改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因而，反 义cSNPs在动物遗传育种中具有非常重要的研究价值和意义。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(MolecularMark-AssistSelection,MAS)， 是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，借助DNA分子标记对遗传资源或育 种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，实现新品种的选育。标记辅助选择主要 经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数 量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术的日渐成熟与丰 富，覆盖整个基因组的标记越来越多，通过与QTL间的连锁分析，可间接实现辅助选择性状 的目的。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。在 肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状有密切相关、并且与数量性状紧密连锁的DNA标记 进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得较大的研究 进展。

目前，主要采用几种不同的路线来筛别SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA 测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸连接反应、PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP方 法等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是其检测费用 昂贵，需要有DNA测序仪等大型仪器，同时需要非常熟练的技术人员和丰富的经验，因此该 方法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法 检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验 过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP 检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物， 且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍 应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因 芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上 所述，利用PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP技术进行SNP检测可能是当前检测SNP最理想的遗 传标记方法。本试验中的forced-PCR-RFLP是在发现SNP位点后通过对引物中引入错配碱 基，使之与SNP位点共同构成酶切位点实现基因分型的一种方法。通过PCR扩增，使用限制性 内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。该方法 既具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，是目前可实际应 用于生产实践的方法。