[发明专利]实时检测活体藻细胞油脂含量的荧光分光光度法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微藻株油脂含量的快速筛选方法，特别是一种实时检测活体藻细胞油 脂含量的荧光分光光度法。

背景技术

目前，在传统的藻细胞油脂含量检测方法中，最经典的实验方法是通过物理方法提取 藻油脂并称重计算，但是这一过程太繁琐，容易引起实验误差，以及测量精度不准的缺点。

1)以BlighEG和DyerWJ为代表的利用油脂干重称量法测定微藻细胞油脂含量的 测定是最经典的藻细胞油脂测定方法。微藻油脂含量测定法最初是利用有机溶剂提取法对 藻细胞进行破壁及油脂的提取，该法在良好的操作条件下可以获得较精准的数据，但是过 程耗时较长，而且还需对藻细胞原料进行准确的称量，提取剂的选择和溶剂的去除程度也 直接影响数据的可靠性。

2)Nilered荧光分光光度法被应用于藻细胞油脂含量的测定的报道，但是由于Nile red试剂的水不溶性，以及环境的pH和溶液离子强度对Nilered对渗入藻细胞的程度是 不一样的，所以应用这种方法必须有一套检测的实验标准参数，而目前统一的针对某种微 藻的Nilered荧光分光光度法的实验研究方法的应用还没被详细报道过。

上述两种方法具有不同的缺点，导致不能快速实时，高通量的测定活细胞油脂含量：

(1)利用传统干重称量法测定油脂含量由于其操作繁琐，如藻粉的制备、油脂的提取、 油脂的干燥等过程需要至少一周才能完成，对于快速测定的要求是没法满足的。

(2)现有的Nilered荧光分光光度法只是定性的实验，没有针对某种微藻实验操作 的标准流程。

发明内容

本发明的目的是要提供一种实时检测活体藻细胞油脂含量的荧光分光光度法，实现高 通量快速筛选高油脂含量微藻株。

本发明的目的是这样实现的：藻细胞油脂含量的荧光分光光度法：不同种属和不同形 态的微藻其结构和形状存在的差异，针对所述的微藻进行实验、测定，不同种属和不同形 态的微藻所需的染色条件有所不同，包括有藻细胞溶液浓度的选择，荧光染色剂剂量的选 定，染色过程的环境的选定以及荧光强度测定条件的参数选择；藻细胞浓度：1×10⁶/ml-8 ×10⁶/ml；藻液体积：5ml；Nilered在水相的溶度：0.5-4μg/ml；漩涡震荡时间：0.5-4min；

具体步骤如下：

(1)、小球藻油脂含量的测定方法：制备含几组相同浓度的悬浮藻细胞，将Nilered 用有机溶剂溶解成0.1mg/ml后按相同剂量加入到藻悬液中；所述的有机溶剂必须经过检 测具有水溶性和细胞渗透性；所述的有机溶剂为二甲亚砜；

(2)、控制染色过程的混合悬液震荡的时间参数为0.5-4min，溶液pH:6-8参数， 确定最佳染色操作过程，操作参数通过荧光显微镜观察来确定；

在荧光显微镜下的A组和B组，在两种条件下的细胞形态和颜色确定染色过程的完成； A组：染色完全的藻细胞，在荧光条件下呈绿色；B组：未染色的藻细胞，在荧光条件下 呈红色；

(3)、实验确定发射波，通过荧光扫描确定合适的发射光波长，不同的藻细胞实验发 射波的波长范围为蓝光激发光源下420-490nm；

(4)、针对不同种属的微藻优化不同的实验操作参数，制定标准的测定方法。

有益效果及优点：由于采用了上述方案，实时快速筛选高油脂含量微藻的优良藻株， 利用一种荧光染色剂Nilered对藻类活细胞的油脂含量进行实时监测分析。Nilered渗 透进藻细胞中与油脂成分进行结合并生成荧光物质，在优化的实验条件下通过检测藻细胞 的荧光强度数值，推算出藻细胞的油脂含量。

实时检测活体藻细胞油脂含量的荧光分光光度法可以根据油脂和荧光强度同比例增 长的效果，通过简单的配置一定浓度细胞染色和进行染色处理及荧光强度测定的步骤，精 确测定活藻细胞的油脂含量。该方法免去了传统干重法油脂测定法中必须制定干燥的藻粉 及油脂的提取等繁琐的步骤，直接利用活细胞的藻液实时快速精确测定油脂含量，实现了 高通量快速筛选出高油脂含量的微藻株。

附图说明

图1是本发明在荧光条件下呈绿色的染色完全的藻细胞图。

图2是本发明在荧光条件下呈红色的未染色的藻细胞图。