[发明专利]一种开花提前的转基因植物的培育方法

权利要求书

1.一种开花提前的转基因植物的培育方法，其特征在于，步骤如下：

1)克隆待转基因的前体序列，并构建含有待转基因前体序列序列的表达载体；

2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；

3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿主植物，获得转基因阳性单株；

4)通过表型验证转基因株系；

步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述克隆所用引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述表达载体还含有草丁膦抗性基因，所述宿主植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，构建步骤1)所述表达载体所用质粒为pCAMBIA3301。

3.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤2)所述农杆菌为农杆菌EHA105。

4.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。

5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，验证miRNA172a对靶基因Glyma03g33470的降解位点，是提取大豆的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。

6.根据权利要求5所述培育方法，其特征在于，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间。

7.根据权利要求4所述培育方法，其特征在于，扩增所述靶基因所用引物的序列如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

8.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)以大豆基因组为模板，以如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，

克隆如核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利用所得序列与质粒pCAMBIA3301构建表达载体；

2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌EHA105中，再利用所得农杆菌侵染拟南芥，获得侵染植物；

3)提取步骤2)侵染植物中的总RNA并合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定，分析确定所转序列对靶基因Glyma03g33470的降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间，鉴定后通过草丁膦抗性筛选，PCR定量鉴定，获得转基因阳性单株；

4)通过与野生型对比验证步骤3)所得转基因阳性单株的开花时间是否提前，获得转基因株系。

9.权利要求1-8任一所述培育方法在作物育种中的应用。