[发明专利]一种开花提前的转基因植物的培育方法

说明书

本发明公开了一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。本发明所公开的方法是将大豆的miRNA172a通过表达载体转移至农杆菌中，再通过农杆菌侵染宿主植株，通过靶基因降解位点的验证和筛选鉴定获得转基因阳性单株。本发明从大豆全基因组中克隆出miRNA172a基因，并通过构建表达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，能够有效提前拟南芥的开花时间。

技术领域

本发明涉及一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一种基本的、具有序列特异性的真核基因组的调节因子，通常在转录水平或者转录后水平调节其靶基因的表达。成熟的miRNAs是一系列小的非编码单链小分子RNA，在动物中，它通常由20-22核苷酸组成，而在植物中通常是20-24个核苷酸大小。MicroRNAs(miRNAs)在植物的生长发育以及植物对环境的适应方面发挥了重要的作用，成为近几年研究的热点。

miR172最早在拟南芥中通过小RNA测序获得的，由于它极度保守，在多种植物中也被相继发现。之前的大多数研究显示miR172通过抑制一系列AP2-like类转录因子参与植物花器官的形成与开花时间调控。然而，到目前为止，对大豆miR172家族的研究相对较少，尚没有以大豆miR172基因培育转基因植物的方法。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种开花提前的转基因植物的培育方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种开花提前的转基因植物的培育方法，该方法的步骤如下：

1)克隆待转基因的前体序列，并构建含有待转基因前体序列序列的表达载体；

2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；

3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿主植物，获得转基因阳性单株；

4)通过表型验证转基因株系。

优选地，步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述克隆所用引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述表达载体，还含有草丁膦抗性基因。

优选地，步骤1)所述表达载体，所用质粒pCAMBIA3301。

优选地，步骤2)所述农杆菌，为农杆菌EHA105；所述宿主植物，为拟南芥。

优选地，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。

更优选地，所述验证降解位点是验证miRNA172a对靶基因Glyma03g33470的降解位点，是提取侵染宿主植物的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。

优选地，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间。

优选地，所述靶基因，扩增靶基因所用引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

所述培育方法的具体步骤如下：

1)以大豆基因组为模板，以如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，克隆如核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利用所得序列与草丁膦抗性基因、质粒pCAMBIA3301构建表达载体；