[发明专利]一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列

权利要求书

1.一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物对和探针序列，其特征在于，所述的引物对为：由序列为GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列为GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR组成的引物对；探针CPIVTM序列为CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。

2.根据权利要求1所述引物对和探针序列,其特征在于,所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：

1）待测模板的制备：取100μl血清或取100mg组织样品，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl;

加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75%乙醇（DEPC处理的水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；

2）使用TaKaRa公司OneStepPrimeScript^TMRT-PCRKit配制反应体系：

试剂用量/终浓度

2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μl/1×

TaKaRaExTaqHS(5U/μl)0.4μl

PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4μl

PCRForwardPrimer(10μM)0.4μl/0.2μM

PCRReversePrimer(10μM)0.4μl/0.2μM

TaqManProbe(10μM)0.8μl/0.4μM

ROXReferenceDyeⅠ(50×)0.4μl/1×

TotalRNA2μl

RNaseFreedH₂O5.2μl

将加好样品的PCR管置于荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环;

山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有山羊副流感病毒3型核苷酸则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达10个拷贝/ml；若待检样品中不含有山羊副流感病毒3型核苷酸则无扩增信号。

3.根据权利要求2所述引物对和探针序列,其特征在于,所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法中其检测灵敏度达10个拷贝/ml。

4.含有权利要求1所述引物对和探针序列的试剂盒。

5.权利要求1所述引物对和探针序列在制备用于检测山羊副流感病毒3型的试剂盒产品中的应用。