[发明专利]一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列

说明书

技术领域

本发明属于动物病原微生物检测技术领域。具体涉及一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸的引物和探针序列。

背景技术

副流感病毒3型(PIV3)属于副粘病毒科呼吸道病毒属成员，是有囊膜的单股负链RNA病毒。该属成员还包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、仙台病毒和牛副流感病毒3型(BPIV3)。副流感病毒3型宿主范围广泛，在自然和实验室条件下均可感染人和多种动物，包括小鼠、豚鼠、牛、马、鹿、犬、猫、猪、绵羊和山羊等。人副流感病毒1型和3型是导致婴幼儿上下呼吸道感染的重要病原；仙台病毒是实验小鼠的重要呼吸道病原体，常造成实验室幼鼠的大量死亡；牛副流感病毒3型可引起牛的“运输热”，当呼吸道有致病性细菌或支原体继发感染时，会引起犊牛大批死亡，给养牛业带来重大的经济损失。

牛的呼吸道疾病综合征又称为“运输热”，临床上以发热、咳嗽、食欲减退、眼睛鼻部分泌物增多，并伴有腹泻为特征。1959年，美国科学家首次证实该病与牛副流感病毒3型有关，并成功分离到病原体。目前，牛副流感病毒3型已在全球范围内流行，尤其以亚洲和美洲发病率最高。我国于2008年之后陆续有牛副流感病毒3型感染的报道，并证实存在BPIV3a和BPIV3c两个基因型。

目前关于羊群中山羊副流感病毒3型感染的报道较少，本研究室自2013年起在江苏、安徽等地的山羊养殖场羊群中检测到副流感病毒3型，发病羊群临诊表现以呼吸道症状为主。经过RT-PCR检测、病毒分离鉴定、血凝试验和测序分析，证实该病毒与人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型均存在较大差异，在进化上处于独立的分支，命名为山羊副流感病毒3型JS2013(李文良,等.山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定.畜牧兽医学报.2015)。

然而，对山羊副流感病毒3型在国内的流行情况尚无详实数据，对于该病原的诊断方法主要以病毒的分离鉴定和中和试验为主，这两种方法耗时长，不适合疾病的快速诊断，荧光定量PCR敏感性高、特异性强、检测时间短、无需进行核酸电泳即可以进行定量分析，是传统方法无法比拟的。

因此，基于以上的研究和当前的需要，申请人根据山羊副流感病毒3型全基因组序列(GenBank登录号：KT215610)，设计了用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针，建立荧光定量PCR方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列。

技术方案

本发明采用以下技术方案：

1、一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物对，其特征在于所述的引物对为：由序列为GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列为GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR组成的引物对。

2、一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的探针，其特征在于所述的探针CPIVTM序列为CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。

所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：

1)待测模板的制备：取100μl血清；或取100mg肺组织，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl。加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75％乙醇(DEPC处理的水配置)，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；

2)使用TaKaRa公司OneStepPrimeScript^TMRT-PCRKit配制反应体系：

将加好样品的PCR管置于荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环。试验结果可以实时监测。