[发明专利]一种检测黄牛PPARα基因单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛PPARα基因 第53869位单核苷酸多态性的方法。

背景技术

随着基因组学新方法和新技术的不断涌现，通过对各项技术进行整合， 使我们可以从基因即分子水平上进行设计来重构畜禽新品种。基于DNA遗 传标记的产生和应用，开创了分子育种的新领域，为动物育种和改良提供了 新的技术支撑，给动物遗传育种带来了美好的前景。SNP作为新的遗传标记 已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)主要是指在基因 组水平上的特定位点由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。SNP 在人类基因组中广泛存在，可能存在着300万～1000万个SNP在人类基因 组中，不同的人群有着不同的SNP分布特征。它是一种最常见的人类可遗传 变异。SNP所表现出的多态性是由单个碱基发生转换或颠换所引起。在基 因组DNA中，任何碱基均有发生变异的可能，因此SNP既有可能存在于基 因序列内，也有可能位于非编码序列上。SNP在富含CG的序列上出现的频 率最高，而且多是胞嘧啶C转换为胸腺嘧啶T，原因是CG中的C在发生甲 基化后会自发地脱氨成为胸腺嘧啶。

SNP作为第三代分子遗传标记，具有以下特征：(1)密度大。SNP是基 因组DNA中普遍存在且频率最高的遗传标记。已有研究表明，SNP出现的 频率在1/1000～10/1000之间，人类30亿个碱基中共有300万以上的SNPs， 其密度高于微卫星DNA标记。(2)易实现自动化分析。组成DNA的碱基有 4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以SNP标记为双等位标记。因此在 检测时表现为非此即彼，在基因组筛选时不用分析片段的长度，往往只需+/ －的分析，这就利于实现自动化技术筛选与检测SNPs。(3)用途广泛。SNP 作为分子遗传标记的一种，在动物遗传育种中具有广泛的功能。主要用于遗 传作图、疾病检测、位点标识和进化分析等。

目前，检测SNP的方法可以分为两大类：一类是基于凝胶电泳的传统方 法，另一类是利用高通量、自动化较高。高通量的检测方法包括直接测序、 DNA芯片、变性高效液相色谱等。直接测序是检测SNP最直接可靠的方法， DNA芯片可以对SNP进行大规模的筛查，但二者的检测费用都是极其昂贵。 变性高效液相色谱方法对于试剂和环境要求较高，不能检测出纯合突变，所 以不是检测SNP的首选方法。基于凝胶电泳的传统方法主要包括PCR-SSCP 与DNA测序结合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、变性梯度凝胶电泳等。 PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，只适合长度小于500bp的小 DNA片段，如果DNA片段太长，DNA单链很难形成稳定发夹结构，且实验 过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法 需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，但由于特异性引物的稳 定性差，对扩增条件要求比较严格，所以操作比较繁琐，因此不适于高通量 SNP的检测。变性梯度凝胶电泳也只能对突变进行较为粗略地检测，不能确 定突变位置和类型。PCR-RFLP由于位点特异性高、操作较简单和成本较低 等，因此被广泛运用于植物基因分型、基因定位、分子鉴定等方面的研究。 综上所述，利用PCR-RFLP法可能是当前检测SNP最理想的遗传标记方法。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PeroxisomeProliferatorActivated Receptor，PPAR)属于类固醇/甲状腺/维甲酸受体超家族，对于胰岛素敏感 性、体内的糖平衡以及脂肪分化和生成方面具有重要调节作用，是目前研究 的热点。该家族可分为三个成员，PPARα、β和γ。PPARα能够影响多种脂 肪酸转运以及代谢基因的转录，有研究表明PPARα所有已知的靶基因都参与 脂质代谢。PPARα在体内主要分布在线粒体脂肪酸氧化效率高的组织，如肝 脏、棕色脂肪组织等，而在白色脂肪组织和软骨中表达量较低。目前，有大 量的研究证明PPARα在肝脏脂质代谢、机体能量代谢、肥胖发生及胰岛素抵 抗等发面发挥着重要作用。