[发明专利]快速检测鲍鱼养殖环境中高致病病原微生物的方法

权利要求书

1.快速检测鲍鱼养殖环境中高致病病原微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

确定鲍鱼养殖环境中存在治病风险且需及时处理，以及无治病风险需但进一步监测的菌限值；

收集鲍鱼养殖环境水样，并提取所收集水样中全部病原菌DNA；

利用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种特定引物对样品中病原菌的总DNA进行荧光定量PCR测定，获得所收集水样中是否存在上述三种病原菌或者病原菌总量是否超过设定的菌限值，以此判断所收集水样是否存在病原微生物的威胁。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

用于检测溶藻弧菌的引物为：

F-引物，5-GTCGGATTCAAGAGTCGGTATT-3；

R-引物，5-TAACCCGCGCGTAAGTATAAG-3；

片断长度AmpliconLength＝136bp；

解链温度Tm＝60；

用于检测河流弧菌的引物为：

F-引物，5-CTCAAGCCATCTCAACCCTAC-3；

R-引物，5-CGGTCGCGATCAACTGATAA-3；

片断长度AmpliconLength＝102bp；

解链温度Tm＝60；

用于检测副溶血弧菌的引物为：

F-引物，5-CTGATAACTTGCCGGACGATAC-3；

R-引物，5-GTTTGCCACGCGAATGTAATC-3；

片断长度AmpliconLength＝101bp；

解链温度Tm＝60。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用鲍鱼在养殖环境中细菌半数致死量的测定结果，确定鲍鱼养殖环境中存在治病风险且需及时处理，以及无治病风险需但进一步监测的菌限值。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，确定菌限值的具体方法如下：

分别将三种细菌涂布于2216E海水固体培养基上，25℃恒温培养24小时；

用无菌人工海水将上述三种细菌的菌苔洗涤下来，制成菌悬液，加入到1L灭菌海水的烧瓶中，并分别调整为菌体浓度为103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml和106CFU/ml四种，放入相应的1L烧瓶中；

剪取藻膜上的鲍鱼，连同藻膜用无菌海水冲洗5次，然后分别放入上述不同菌体浓度的烧杯中，每种浓度共设平行样4个，实验过程中保持温度为25℃，不添换海水，不另外加饲料，观察鲍鱼病变死亡情况。

观察时，分别于24h、48h和72h观察鲍鱼活动情况，计算致死率，并用ReedMuench法分别计算24h、和72h的半致死量。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取水样中全部微生物的DNA的方法如下：

使用10um无菌滤膜将收集到的鲍鱼养殖环境的水样过滤，去除固体杂质及真菌，再利用0.22um无菌滤膜过滤水样，把水样中的细菌微生物全部固定在0.22um滤膜上；

收集0.22um滤膜，用无菌剪刀剪碎置放入50ml无菌离心管中，添加生理盐水，充分振荡，然后收集滤膜上的微生物；

反复冻融及溶菌酶溶解细胞壁，并利用SDS和蛋白酶K变性蛋白质破坏细胞膜，利用CTAB除掉多糖，最后通过酚/氯仿/异戊醇抽得到样本微生物总DNA,室温干燥后溶于30μL去离子水中，并置于-20℃备用。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对样品中病原菌的总DNA进行荧光定量PCR测定的具体方法如下：

将获得的溶解DNA作为模板，选用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种病原菌特定引物进行荧光定量PCR扩增；

PCR反应体系如下：

8.5ul蒸馏水，SYBRGreenRealtimePCRMaster12.5ul，浓度50ng/ul的引物各1ul，浓度50ng/μL的2μLDNA模板共25ul；

PCR反应条件为94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30min，72℃延伸30s，循环40次，最后72℃延伸补平5min终止反应。72℃到95℃，每升高0.5℃检测一次荧光信号，绘制溶解曲线，测得三种病原菌的含量。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，针对荧光定量PCR测定结果，采取的措施如下：

测定结果显示水样中不存在溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种病原菌，则无需消毒处理；

测定结果显示水样中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种病原菌中的任一种超过菌限值，存在对鲍鱼有治病风险，则需及时消毒处理；

测定结果显示水样中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种病原菌中的任一种超过菌限值，但对鲍鱼无治病风险，则需进一步监测。