[发明专利]快速检测鲍鱼养殖环境中高致病病原微生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鲍鱼养殖，具体涉及快速检测鲍鱼养殖环境中高致病病原微生物的方法。

背景技术

鲍鱼肉质鲜美，营养丰富，其由于富各种含氨基酸、维生素及人体必需的多种微量元素和矿物质，被誉为海味八珍之冠。除了营养外，近代医学家也认为鲍鱼有滋补强壮之效，有温补肝肾、益精明目、滋阴清热、可明目和降血压，故鲍鱼即是丰盛宴席上的美味，也是食物疗法中佳肴，同时有研究表明从鲍鱼提取的多糖具有很好的抗肿瘤、提高免疫力等作用。鲍壳是著名的中药“石决明”，有平肝潜阳，清肝明目的功效，是治疗高血压，头昏、肝硬化的良药，临床上常用其代替羚羊角。

20世纪中期鲍鱼的自然捕获量每年仅有200至200吨，70年代广东省进行鲍鱼的人工养殖和幼苗实验并获得成功，80年代作为重点推广性生产，开始被逐步推广，近几年来，随着鲍鱼养殖技术的日趋成熟，我国鲍鱼的人工养殖发展速度惊人，人工养殖的规模不断扩大，已经成为世界大型的鲍鱼养殖国。

随着鲍鱼养殖规模的不断扩大，密集养殖程度日益增强，养殖环境的逐步恶化，各种病害频繁发生，如脓鲍病、“掉板症”等，导致许多养鲍场严重亏损甚至倒闭，成为制约鲍鱼养殖业进一步发展的重要制约因素，其中，病原微生物被认为是导致养殖鲍鱼高死亡率的重要因素鲍鱼养殖遇到的各种病害，如大连地区1993年夏季发生了河流弧菌引起皱纹盘鲍的“脓鲍病”；2000年东山县爆发性流行鲍病由溶藻弧菌和副溶血弧菌共同作用导致；2006年周晶等人研究发现溶藻弧菌是导致南方杂色鲍幼苗大规模死亡(业内称之为“掉板症”)的致病菌；2011年王智等人从九孔鲍苗病体上分离出的病原菌为溶藻弧菌。

结合以往的报道和研究发现，鲍鱼细菌性疾病多数由溶藻弧菌、副溶血弧菌和河流弧菌引起，而且，有些细菌如副溶血弧菌还可以导致人类的疾病。因此，如何快速检测鲍鱼养殖环境中的高致病病原微生物对于鲍鱼的人工养殖具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速检测鲍鱼养殖环境中的高致病病原微生物的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种快速检测鲍鱼养殖环境中高致病病原微生物的方法，包括以下步骤：

确定鲍鱼养殖环境中存在治病风险且需及时处理，以及无治病风险需但进一步监测的菌限值；

收集鲍鱼养殖环境水样，并提取所收集水样中全部病原菌DNA；

利用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三种特定引物对样品中病原菌的总DNA进行荧光定量PCR测定，获得所收集水样中是否存在上述三种病原菌或者病原菌总量是否超过设定的菌限值，以此判断所收集水样是否存在病原微生物的威胁。

在上述方法中，用于检测溶藻弧菌的引物为：

F-引物，5-GTCGGATTCAAGAGTCGGTATT-3；

R-引物，5-TAACCCGCGCGTAAGTATAAG-3；

片断长度AmpliconLength＝136bp；

解链温度Tm＝60；

用于检测河流弧菌的引物为：

F-引物，5-CTCAAGCCATCTCAACCCTAC-3；

R-引物，5-CGGTCGCGATCAACTGATAA-3；

片断长度AmpliconLength＝102bp；

解链温度Tm＝60；

用于检测副溶血弧菌的引物为：

F-引物，5-CTGATAACTTGCCGGACGATAC-3；

R-引物，5-GTTTGCCACGCGAATGTAATC-3；

片断长度AmpliconLength＝101bp；

解链温度Tm＝60。

在上述方法中，利用鲍鱼在养殖环境中细菌半数致死量的测定结果，确定鲍鱼养殖环境中存在治病风险且需及时处理，以及无治病风险需但进一步监测的菌限值。

在上述方法中，提取水样中全部微生物的DNA的方法如下：

使用10um无菌滤膜将收集到的鲍鱼养殖环境的水样过滤，去除固体杂质及真菌，再利用0.22um无菌滤膜过滤水样，把水样中的细菌微生物全部固定在0.22um滤膜上；

收集0.22um滤膜，用无菌剪刀剪碎置放入50ml无菌离心管中，添加生理盐水，充分振荡，然后收集滤膜上的微生物；