[发明专利]MSC促进血管新生能力的定量方法有效

专利信息
申请号: 201610007156.1 申请日: 2016-01-06
公开(公告)号: CN105463058A 公开(公告)日: 2016-04-06
发明(设计)人: 梁璐;赵钦军;韩之海 申请(专利权)人: 北京汉氏联合生物技术股份有限公司
主分类号: C12Q1/06 分类号: C12Q1/06
代理公司: 北京国帆知识产权代理事务所(普通合伙) 11334 代理人: 李增朝
地址: 100176 北京市大兴区经*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: msc 促进 血管 新生 能力 定量 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及干细胞领域,具体而言,涉及MSC促进血管新生能力的 定量方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSC)是一类源于中胚层 的异质细胞群,可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、 组织修复、免疫调节能力,可以向中胚层分化,例如:脂肪细胞、骨细 胞、软骨细胞等,其中,胎盘和脐带来源的MSC具有分化潜力大、增殖 能力强、免疫原性低、取材方便,没有道德理论问题的限制、易于工业 化制备等特征,是最具临床前景的多功能干细胞之一。

血管是人体的重要组成部分,它构成了循环系统的主体。长期以来, 对于人自体血管内皮细胞的各项研究绝大多数是基于人脐静脉内皮细 胞(Humanvascularendothelialcell,HUVEC)。一方面,脐带来源 丰富,容易获取;另一方面,脐带血管没有分支,便于操作,而且脐带 有着理想的长度,能够保证细胞的足够量。

MSC的促血管新生的特性对肢体缺血的治疗有着非常重要的临床意 义。但是目前缺乏评价MSC的促血管新生能力的方法,阻碍了MSC在治 疗肢体缺血方面的临床应用。

本发明旨在建立一种MSC促进血管新生能力的定量方法,对MSC促 进血管新生能力进行评价,以指导临床应用,保证MSC的疗效。

发明内容

本发明的第一技术方案为一种MSC促进血管新生能力的定量方法, 其特征在,建立共培养体系,

在该共培养体系中共培养MSC和内皮细胞,其中,MSC通过因子分 泌的方式来促进内皮细胞的增殖,

检测所述内皮细胞的增殖数量,

由所述内皮细胞的增殖数量,对MSC的促血管新生能力进行定量和 评价。

第二方案基于第一技术方案,其特征在于,所述内皮细胞为HUVEC 细胞。

第三方案基于第二技术方案,其特征在于,还检测VEGF因子,由 VEGF因子的数量对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。

第四方案基于第三技术方案,其特征在于,在建立共培养体系时, 确定孵育时间、共培养时间、MSC和内皮细胞的细胞数的比例。

第五方案基于第四技术方案,其特征在于,所述孵育时间为2h、共 培养时间为72h、MSC和内皮细胞的细胞数的比例为1/10。

第六技术方案基于第一至第五中的任一技术方案,其特征在于,在 建立共培养体系时,应用不同来源的MSC与内皮细胞进行共培养,选择 促进内皮细胞增殖数量最少的MSC细胞,进行移植治疗,确认其促血管 新生能力。

附图说明

图1示出了培养的HUVEC细胞;

图2示出了CCK8孵育HUVEC细胞2h后标准曲线;

图3示出了CCK8孵育HUVEC细胞4h后标准曲线;

图4示出了外源添加VEGF因子量与HUVEC细胞数之间标准曲线;

图5示出了MSC和HUVEC共培养48h后HUVEC的增殖量;

图6示出了MSC和HUVEC共培养72h后HUVEC的增殖量;

图7示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖;

图8示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖;

图9示出了不同来源的MSC样品促进HUVEC的增殖;

图10示出了激光多普勒检测缺血下肢的血流灌注量,证明MSC在体 内能够促进血管新生。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方案对本发明进行说明,具体实施方案应 该理解为仅为举例说明,不是限定性的,不应以下述举例说明来限定本 发明的保护范围。

本实施方式中,共培养体系中,在上腔中种植MSC,通过分泌因子而 不是直接接触作用于下腔的HUVEC,促进HUVEC的增殖,应用CCK8试剂 盒检测HUVEC的增殖数量,以此来衡量MSC促血管新生能力,评价其生 物学效力。

以下对MSC促血管新生能力的量化和评价进行说明。在本实施方式 中,内皮细胞采用HUVEC。具体方法如下:

(1)从脐带中分离HUVEC细胞,在T75细胞培养瓶中进行培养,培 养条件是37℃,5%CO2

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