[发明专利]一种抗氧化药物筛选试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗氧化药物高通量筛选试剂盒及其使用方法。

背景技术

近年来随着社会的快速发展，快节奏的生活环境使人们极易受到各种压力所致的氧化应激反应损伤，而过度的氧化应激损伤是导致如早衰、糖尿病以及心血管系统疾病等严重病症不可忽视的因素。因此研究毒性低、抗氧化效果显著的药物迫在眉睫。

现阶段抗氧化药物筛选所常用体内动物模型主要为细胞、小鼠、大鼠。小鼠和大鼠是抗氧化药物药效检测的理想模型，但其存在试验周期长、成本高、操作繁琐以及不能高通量等问题而大大限制了其在大量抗氧化药物初筛方面的应用。细胞作为体外抗氧化模型，虽然易于在实验室进行大规模测定，节省测定时间和成本，但与体内筛选相比，其所得结果往往相关性较差。

秀丽隐杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌（E.coli）；世代周期短，通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；而秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，且可以同步化，因此秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势，成为体内抗氧化药物高通量筛选的理想模型。

但上述秀丽隐杆线虫体内抗氧化药物高通量筛选模型的建立需要极高的技术和经验，即使在发达国家，线虫高通量药物筛选技术目前仍停留在实验室阶段，还未进入产业化阶段，而且目前很多线虫的筛选模型还没有知识产权保护。

对此，本发明特提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够高通量筛选抗氧化药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法。供本领域研发人员高通量准确地筛选抗氧化药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出抗氧化药物。

本发明的另一个目的是提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法。

本发明提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下试剂：

①、试剂A：秀丽隐杆线虫悬液；

②、试剂B：线虫培养基；

③、试剂C：大肠杆菌OP50；

④、试剂D：2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂；

所述试剂盒还含有多孔板，该多孔板为黑色，带有封口膜。封口膜可减缓培养基中的水分散失。所述多孔板为384孔微孔板。

所述试剂A的浓度为50条秀丽隐杆线虫/20μl，试剂C的浓度为10mg大肠杆菌/ml，试剂B的体积为25ml。

所述秀丽隐杆线虫的株系为野生型N2。

所述试剂A中的秀丽隐杆线虫为经同步化后，孵化至L1期的秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm离心3min，去除上清；加入裂解液；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，再加入1ml M9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时，获得同步化后孵化至L1期的秀丽隐杆线虫。

所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。冻干粉在使用时需使用培养液将其配置为浓度为10mg/ml的菌液，培养液可使用S液或M9缓冲液。

所述试剂B为S液培养基。

本发明还提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法：

（1）采用抗氧化药物筛选试剂盒筛选抗氧化药，设定空白对照组和药液测定组，将多孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元；

（2）药液测定组，在无菌条件下将试剂B、含有待测药液的溶液、5μl 试剂C以及20μl试剂A依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；

（3）空白对照组，在无菌条件下将试剂B、与待测药液的溶液等量的无菌水或溶媒、5μl 试剂C以及20μl试剂A依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；其中，所述有机溶媒的溶液为DMSO、乙醇。

（4）加样完成后用封口膜将多孔板密封，并将其置20℃恒温摇床中震摇培养96小时；

（5）向所有加样孔中依次加 2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂，使2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂的终浓度为100μ M，20℃恒温处理30min；

（6）用荧光酶标仪在激发光504nm，发射光529nm条件下测定多孔板中各处理组的荧光，荧光值即代表活性氧水平；