[发明专利]猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)纳米颗粒疫苗，其特征在于含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒以及佐剂，其中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒中包埋有纯化灭活的完整PRRSV抗原。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于灭活前的PRRSV滴度为1×10⁵-1×10⁷TCID₅₀/ml，灭活后的疫苗中含有20-60μg/ml纯化灭活的完整PRRSV抗原。

3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于包埋有纯化灭活的完整PRRSV抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒是通过以下方法制备得到的：

称取PLGA 50/50 750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其终浓度为15％(w/v)，加入含5毫克纯化灭活的完整PRRSV抗原的溶液100微升，用匀浆器以6000rpm速度混匀90秒，获得均匀混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)的聚乙烯醇溶液,匀浆器中混匀5分钟，最后室温搅拌过夜让溶剂挥发，用蒸馏水通过三次11000g离心洗涤3次，湿的纳米颗粒冻干或4℃保存，即得。

4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的纯化灭活的完整PRRSV抗原是通过以下方法制备得到的：

(1)病毒培养

细胞工厂培养Marc-145细胞，培养基为含10％灭活胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM培养液，培养条件为37℃，5％CO₂环境；

MARC-145细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含10％胎牛血清的DMEM培养基和微载体cytodex 1的生物反应器，37℃培养3-4天，培养液pH7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速；PRRSV以0.01MOI感染，分别在第7、11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液感染；

(2)澄清

收获的病毒培养液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.8μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度；

(3)离子交换层析

澄清的病毒液加入经平衡缓冲液平衡的离子交换层析柱，用洗脱液进行洗脱；

其中，所述的平衡液为含有150mM NaCl的20mM Tris溶液，pH＝7.5；所述的洗脱液为含有600mM NaCl的20mM Tris溶液，pH＝7.5；

(4)超滤透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用100KD膜超滤透析，透析液为含有150mM NaCl的20mM Tris溶液，pH＝7.5；

(5)蔗糖密度梯度超速离心

30-60％蔗糖密度梯度超速离心病毒液，21000rpm的转速下离心2小时，收集分布在蔗糖区带的病毒液，用pH＝7.5的，含有150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液稀释至原来体积的12-13倍；

(6)灭活

纯化的病毒用RPMI 1640稀释至1×10⁷-1×10⁸TCID₅₀/ml，用0.1M双乙烯亚胺37℃灭活1小时，0.1mM磷酸硫代纳37℃中和2小时；

(7)透析

用100KDa的膜浓缩6倍，用pH＝7.5的，含有150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液透析；

经以上方法制备的纯化灭活的完整PRRSV抗原的含量相当于灭活前的0.5×10⁶TCID₅₀-2.5×10⁶TCID₅₀/mL。

5.如权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于所述的PRRSV为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV-JXM-F5株，其为在MARC-145细胞上传至5代的适应株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.9453，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日。

6.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述的佐剂为卡介菌裂解物。

7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述的卡介菌裂解物为卡介菌D2BP302S11的裂解物 。