[发明专利]猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗，特别涉及一种含有包埋有灭活的PRRSV抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒及卡介菌裂解物的猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗，本发明属于生物制药技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是猪的慢性病，在全球养殖猪的国家流行，国内流行PRRS，每年造成经济损失约400亿。猪繁殖与呼吸综合症病毒((Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus，PRRSV)是PRRS的病原，PRRSV是动脉炎病毒科的一双链RNA病毒，有二种基因型，欧洲型(I型)和美洲型(II型)。每种基因型又有多种遗传谱系。PRRSV病毒基因型、抗原性变化多样，在自然界容易变异、重组。

PRRSV感染机体后2天到数周可重塑免疫系统，通过重要抗病毒细胞因子生成减少和一些负向抑制免疫反应的细胞因子生成增强抑制机体免疫反应。除此之外，猪感染PRRSV后，病毒中和抗体生成延迟，感染3-4周后才产生中和抗体且水平低下。自PRRSV病毒发现以来，国内外开发了灭活和减毒修饰活疫苗(Modified live，PRRS-MLV)用于PRRSV控制。尽管如此,PRRS-MLV对易感猪有传播疫苗突变株的风险，活疫苗株也有毒力返祖的可能，对异型基因病毒攻击保护力低，不能消除病毒感染。灭活疫苗尽管安全性好，但免疫原性弱。因此，急需研制出一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的PRRSV疫苗。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的PRRSV疫苗。

为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)纳米颗粒疫苗(命名为NP-PLGA-PKWAg)，其特征在于 含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒以及佐剂，其中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒中包埋有纯化灭活的完整PRRSV抗原。

在本发明中，优选的，灭活前的PRRSV滴度为1×10⁵-1×10⁷TCID₅₀/ml，灭活后的疫苗中含有20-60μg/ml纯化灭活的完整PRRSV抗原。

在本发明中，优选的，包埋有纯化灭活的完整PRRSV抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒是通过以下方法制备得到的：

称取PLGA 50/50750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其终浓度为15％(w/v)，加入含5毫克纯化灭活的完整PRRSV抗原的溶液100微升，用匀浆器以6000rpm速度混匀90秒，获得均匀混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)的聚乙烯醇溶液,匀浆器中混匀5分钟，最后室温搅拌过夜让溶剂挥发，用蒸馏水通过三次11000g离心洗涤3次，湿的纳米颗粒冻干或4℃保存，即得。

其中，优选的，所述的纯化灭活的完整PRRSV抗原是通过以下方法制备得到的：

(1)病毒培养

细胞工厂培养Marc-145细胞，培养基为含10％灭活胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM培养液，培养条件为37℃，5％CO₂环境；

MARC-145细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含10％胎牛血清的DMEM培养基和微载体cytodex 1的生物反应器，37℃培养3-4天，培养液pH7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速；PRRSV以0.01MOI感染，分别在第7、11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液感染；

(2)澄清

收获的病毒培养液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.8μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度；

(3)离子交换层析

澄清的病毒液加入经平衡缓冲液平衡的离子交换层析柱，用洗脱液进行洗脱；

其中，所述的平衡液为含有150mM NaCl的20mM Tris溶液，pH＝7.5；所述的洗脱液为含有600mM NaCl的20mM Tris溶液，pH＝7.5；

(4)超滤透析