[发明专利]一种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌及筛选方法和应用

权利要求书

1.一种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：名称为16#，分类 名称为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏编号为：CGMCCNo.11898，保藏日期：2015 年12月22日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心。

2.一种如权利要求1所述的能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌的筛选方 法，其特征在于：步骤如下：

⑴菌株的筛选和分离：

筛选来自处理生活垃圾的土壤中的菌株，并将其冻干成菌粉；

①富集培养：称取采集到并冻干的菌粉置于大麻富集液体培养基中，所述菌粉与大麻 富集液体培养基的比例g：mL为1：150，在37℃下，180～220r/min富集培养24小时；

②初筛：富集培养后的菌液按照10倍梯度稀释：用灭过菌的生理盐水将富集的菌液稀 释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7不同稀释度的样品悬液，振荡混匀后分别吸取10^-5、 10^-6、10^-7的菌悬液200μL，涂布于果胶筛选固体培养基或木聚糖筛选固体培养基中，在37℃ 下倒置培养24小时，通过刚果红显色，测量透明圈直径R和菌落直径r，以R/r的比值来初步 判断菌株的产酶能力；

然后挑取长势较好，R/r的比值较大的单菌落，点接到果胶筛选固体培养基或木聚糖筛 选固体培养基中，在37℃下倒置培养24小时，挑选R/r的比值较大的单菌落在LB固体培养基 中分离纯化；

这样分离纯化后所得的细菌既能产果胶酶又能产木聚糖酶，然后把这些细菌保藏于终 质量浓度为15％的甘油管中，于-80℃冻存备用；

③复筛：先将初筛所保藏的细菌在LB固体培养基中活化，以一环的接种量接种到装有 50mL的液体LB的250mL的三角摇瓶的培养基中，37℃下摇瓶培养16～24小时作为种子液，菌 体浓度OD₆₀₀达到2～2.6；

称取4-10g原麻，先沸水浴处理20～30min后装入250mL的三角摇瓶中，接种5～10mL，以 浴比1:20～25加入含有0.2％氮源的自来水，所述氮源为硫酸铵、硝酸铵、尿素、草酸铵、碳 酸铵中的一种或几种的混合物，在37℃下、180～220r/min脱胶10～12小时后取出，检测残 胶率，选取残胶率低的菌株作为脱胶菌，命名为16#；

⑵菌株的鉴定：

菌株的个体形态鉴定：对所筛得的脱胶细菌首先进行形态学鉴定，发现16#菌菌落呈乳 白色，菌落较大、粘稠、表面光滑不透明，边缘整齐，较老的菌体表面起褶皱；经过革兰氏染 色都显阳性，杆短小，且在菌体中央形成芽孢，初步断定为芽孢杆菌属；

16SrDNA基因序列测定和分析：以16#菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增16SrDNA并 测序；

在NCBI上进行Blast分析表明：16#菌株的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌16SrDNA序列 的一致性高达99％，即得能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法， 其特征在于：所述步骤⑴①中大麻富集液体培养基为：

大麻粉末2.0g，硝酸铵0.2g，磷酸氢二钾0.05g，硫酸钠0.05g，蒸馏水100mL，pH7.0。

4.根据权利要求2所述的能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法， 其特征在于：所述步骤⑴②中果胶筛选固体培养基为：果胶0.5g，硝酸铵0.2g，磷酸氢二钾 0.1g，硫酸钠0.05g，硫酸镁0.06g，琼脂粉2.0g，刚果红0.02g，蒸馏水100mL，pH7.0～7.5； 或者，所述步骤⑴②中木聚糖筛选固体培养基为：木聚糖1.0g，硝酸钾0.1g，硫酸镁0.05g， 氯化钠0.05g，磷酸氢二钾0.05g，刚果红0.02g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，pH7.0～7.5。