[发明专利]一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学中糖工程领域，涉及胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的第 1405和1406位核苷酸的特异性突变，多肽及蛋白快速简易葡萄糖基化的酶合成方法。

背景技术

胸膜肺炎放线杆菌在1957年首次报道,早称为副溶血嗜血杆菌，1964年被正式宣 布为猪胸膜肺炎的病原体，1983年重新分类后，DNA的研究显示它与林氏放线杆菌更密切相 关。属于巴氏杆菌科，放线菌属，是一种革兰氏阴性多形态小球杆菌，兼性厌氧，有荚膜，鞭 毛和菌毛，不能形成芽孢，是一种呼吸道寄生菌，主要存在于患病动物的肺部和扁桃体，病 猪和带菌猪是本病的主要传染源。

糖蛋白在生命活动中扮演着重要的角色,如细胞信号识别、神经调控、细胞间的信 息传达及免疫调节等,因此引起了人们的广泛关注。糖肽是位于糖蛋白核心结构区域的由 糖基与氨基酸或多肽链以共价键相连而形成的缀合物。含有糖肽的物质与糖蛋白相比,具 有多种相似的重要生物功能,同时又没有糖蛋白巨大的分子量和复杂的结构,因此成为研 究糖蛋白的重要模型。而且糖肽类药物研究非常广泛，糖肽类药物主要用于治疗癌症、代谢 紊乱相关的重大疾病，这些疾病相关的药物拥有全球非常重要的市场。蛋白糖基化修饰一 共有5种类型，按重要性排序分别是N－O－P－C－和G－糖基化，这些糖基化修饰均通过 连接寡糖基团到蛋白表面，但其修饰位点不同，其中以N-糖基化最为普遍，其通过将聚糖连 接到天冬氨酸或精氨酸侧链的氮原子上对蛋白进行修饰，是目前研究的最为透彻的糖基化 过程。

一直以来，大部分药物糖蛋白依赖于直接从生物体中提取，但因为数量有限成本 高昂存在病毒感染等问题，无法广泛运用于临床。因此，目前的研究主要集中在开发糖蛋白 表达载体，经过适当的糖基化改造，用于药用蛋白质的生产。ApNGT就属于N-糖基化修饰的 一种重要的转移酶。

发明内容

本发明公开了一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其特征在于，所述ApNGT突变 基因的突变位点在于所述ApNGT基因从5′端起第1405个核苷酸，突变结果为C到G,第1406 个核苷酸，突变结果为A到C，所述的ApNGT基因序列见SEQNO:1。其编码的氨基酸突变位点 第620个氨基酸，突变结果是由Glutamine到Alanine，序列见SEQNO:2。

本发明所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中的引物SEQNO:3 CATTTCCATTTTGCATTGGGGGCATCAAACGGTATTAC为特异扩增胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因 的上游引物；SEQNO:4GCCCCCAATGCAAAATGGAAATGCACTTTCACTTTG为胸膜肺炎放线杆菌的 ApNGT基因的下游引物。

本发明所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中1）包含N-X-S/T序列的多肽进行 糖基化修饰，反应为体系30ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl₂(5mM),UDP-Glc(10mM), NaCl(10mM),ApNGT(0.3mg/ml),Peptide(1mM),用ddH₂O补齐，37℃水浴条件下反应45分 钟，采用MALDI-TOF定性和HPLC定量；

2）在包含N-X-S/T序列的蛋白hmw1ct(NCBI:Accession:WP_014550671.1GI: 504363569,AtaC1866–2428)进行糖基化修饰，反应体系为200ul，包含pH=8.0Tris-HCl (50mM),MgCl₂(5mM),UDP-Glc(5mM),NaCl(100mM),ApNGT(0.3mg/ml),Protein(1mg/ml), 37℃反应一个小时，使用MALDI-TOF定性。

本发明进一步公开了胸膜肺炎放线杆菌ApNGT基因在制备提高糖基化多肽的效率 方面的应用。实验结果表明：本发明提供的胸膜肺炎放线杆菌ApNGT基因（改造型酶），可以 大量提高糖基化多肽的效率，可以实现体外多肽糖基化，通过绿色环保，简易的操作可以大 量获得糖基化多肽，突破了现有化学方法合成糖肽步骤繁多，成本高昂，选择性差的屏障。 同时突变的ApNGT在大肠杆菌中表达后，在多肽水平上糖基化效率与野生型的ApNGT相比提 高了160多倍，这为多肽类和蛋白类生物制品糖基化修饰提供了极大便利。突变后ApNGT稳 定性良好，可作为一种工具酶易于商品化生产，具有广泛的应用前景。