[发明专利]用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其特征在于，核苷酸序列如下：

突变上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，

突变下游ARMS引物JM1-R：SEQIDNO:2，

检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，

阻断探针JW1-B：SEQIDNO:4；

其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。

3.用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：

外控上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，

外控下游引物JW1-R：SEQIDNO:5，

外控检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。

5.根据权利要求4所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：

内控上游引物IC-F：SEQIDNO:6，

内控下游引物IC-R：SEQIDNO:7，

内控检测探针IC-P：SEQIDNO:8，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。

6.根据权利要求5所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生1849G>T碱基变化的CKIT基因片段>gi|568815589:5073601-5074000的阳性质粒，含有JAK2基因保守序列>gi|568815589:5054501-5054900段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。

7.根据权利要求5所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为两种：

检测反应体系：包括用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH₂O；

质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH₂O；

所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg²⁺。

8.权利要求7所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：

首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；9<Ct_质控≤18；然后按照△Ct＝Ct_检测-Ct_质控判定，△Ct≤8为阳性，△Ct>8为阴性；

所述Ct_检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct_质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。

9.根据权利要求8所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的条件为：

95℃10min；

92℃15sec，58℃1min，共15个循环；

92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。