[发明专利]用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms，MPN)的单病种发病率大多在1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ET、IMF中具有较高的突变几率(依次为～90％、～50％、～50％)。

JAK2是一类酪氨酸蛋白激酶，与造血生长因子受体结合后，通过信号转导子和转录激活子(STAT)来影响基因的转录调节(JAK-STAT途径)。JAK2基因V617F是在第14外显子617位点发生的点突变(G1849T)，缬氨酸(valine，V)被苯丙氨酸(phenylalanine，F)取代。Val617位于JH2(假激酶区)，JH2与JH1(激酶区)结合并抑制其活性；V617F突变使JH2失去了对JH1激酶活性的抑制作用，导致了JAK2的持续活化，在无需配体和造血生长因子受体结合的情况下，导致造血细胞的异常增生。

骨髓增殖性疾病(MPD)的遗传学基础长期不明，直到2005年研究人员在本类疾病中发现存在JAK2点突变(V617F)，才使MPD的诊治进入了一个新纪元。除在体检中发现外周血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突变对患者的诊断具有重要的意义。2008年，随着对MPD的肿瘤本质得到确认，WHO将MPD改名为MPN，并在修订的2008WHO分类系统中，将是否存在JAK2基因V617F突变列入MPN(包括PV、ET、IMF)的诊断标准。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20～30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1～2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

近年来，随着核酸扩增技术的不断优化，国外开始报道采用外周血标本检测游离DNA中基因突变的方法。外周血取样不仅取材简便，且检测准确度与组织标本的结果符合率较高。这不仅极大的促进了靶向药物基因突变检测方法的研究进展，也使以游离DNA为靶分子对临床药物疗效及预后进行实时检测成为研究的热点。但外周血中癌细胞突变DNA存在于大量野生型基因背景中，其比例较低。因此，需要高性能的检测技术来实现低突变含量的检出。

发明内容

为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，灵敏度高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。

本发明提供的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：

突变上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，

突变下游ARMS引物JM1-R：SEQIDNO:2，

检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，

阻断探针JW1-B：SEQIDNO:4；

其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。

表1：JAK2基因V617F热点突变