[发明专利]一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测技术领域。

背景技术

牛结核是由牛结核分枝杆菌引起的人兽共患传染病。在国际上已引起巨大经济损失，牛结核可以感染其他反刍动物和人类，野生动物是其储存宿主，给疾病控制与根除造成很大困难。目前，用于牛结核标准诊断方法是用结核菌素进行皮内试验，该方法和其他细胞介导的免疫学检测（如r-IFN试验，淋巴细胞增生试验）均有一些优缺点。首先是由于皮内试验是机体对抗原的迟发型变态反应，敏感性和特异性较低，也不可能确定对结核菌素反应的是牛结核分枝杆菌，还是禽结核分枝杆菌，或是环境中的其他分枝杆菌。其次，在感染早期细菌载量虽然较少，但以细胞介导的免疫反应为主，而在感染严重期细菌载量虽然较高但细胞介导的免疫反应可能缺失，动物可能成为对细胞介导的免疫反应无应答。第三，72小时内需要操作动物个体两次，以获得检测结果。第四，细胞介导的免疫学检测价格昂贵，需要专业培训，解读检测结果。第五，环境中的分枝结核杆菌或BCG疫苗免疫的动物可能使检测结果成为假阳性。因此，需要建立敏感、易操作和应用的检测牛结核的血清学方法，这种方法能够区别牛结核和禽结核，或其他环境分枝结核杆菌。

近年来有一些用于牧场检测的血清学方法，但敏感性较低，特异性也较差，或许是由于使用了病原分支杆菌和环境分支杆菌表达的抗原提取物。这可以通过利用病原唯一抗原进行加以改进，而且已经取得一定进展。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒。

本发明包括牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体、底物显色液、终止液；所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原为以下五种多肽抗原中的至少任意一种：

bTB-p-1 MAEMKTDAATLAQEAGNFMTEQQWNFAGIEAAAS；

bTB-p-2 QEAGNFERISGDLKTQAGIEAAASAIQGNVTS；

bTB-p-3 VVRFQEAANKQKQELDEIAIQGNVTSIHSLLDEG；

bTB-p-4 NIRQAGVQYSRADEEQQQKWDATATELNNALQNL；

bTB-p-5 RADEEQQQALSSQMGFGQAMASTEGNVTGMFA。

所述五种多肽抗原为利用牛结核分支杆菌特异性多肽，采用体外人工合成方法取得的多肽抗原。

本发明利用人工合成多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 检测试剂盒。

本发明的有益效果：本发明采用牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本发明的牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA 检测试剂盒检测牛结核分枝杆菌抗体，降低了检测成本，有利于推广使用。

进一步地，本发明所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板的制备方法是：取96孔酶标板，每孔100μL牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL～5μg/mL，用PBST 洗涤液250μl/ 孔洗涤2～4 次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，放入真空袋，4℃、抽真空保存。

所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清；所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。所述标准阳性、阴性血清用于评价试剂盒检测结果的有效性。

所述抗体稀释液为0.1%BSA，以用于保持血清抗体的效价和稳定性，减少非特异性。

所述用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体是用HRP保护液按1：2000-1：5000 比例稀释后的抗牛IgG酶标抗体。保护液保护酶标抗体的稳定性和效价。

所述底物显色液为TMB，使阳性样本呈现不同深浅颜色，从而判定阳性的强弱。

所述终止液为0.1SDS%或2M的H₂SO₄，使酶促反应终止。

具体实施方式