[发明专利]一种检测单碱基突变的方法及应用

权利要求书

1.一种非疾病诊断为目的的检测单碱基突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据需要检测的目标基因或DNA片段的序列设计引物，对待测样本和参照分别进行PCR扩增；

(2)将两组扩增产物形成的异质双链产物用CEL I酶切，酶切产物经电泳检测确定单碱基突变；

(3)回收CEL I酶所切开的两个片段，每个片段分别与带有A、T、G或C粘性末端的4种人工接头连接；

(4)把基于人工接头序列设计的反向引物与扩增目标基因或DNA片段的上游引物以及基于人工接头序列设计的正向引物与扩增目标基因或DNA片段的下游引物组成两对引物，分别以每个连接产物为模板进行PCR扩增；

(5)对所有PCR产物进行电泳检测，所得结果与单碱基错配类型的对应关系如下：

其中“√”表示有扩增。

2.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，步骤(2)中确定单碱基突变样本的方法为：CEL I酶切产物的电泳结果，如果只有一条目的基因条带，说明待测样本中不存在单碱基突变；除目的基因条带外还有2条新条带，并且两者的长度之和与目的基因大小一致，说明存在单碱基突变。

3.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述异质双链产物的制备方法为：将等质量的参照扩增产物和待测样本扩增产物混合，再进行高温变性和降温复性。

4.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述异质双链产物的制备方法为：在PCR扩增时用参照与待测样品等质量混合的DNA作为模板，再将扩增产物进行高温变性和降温复性。

5.如权利要求3或4所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述高温变性条件为：94℃变性5min；所述降温复性条件为：先按2℃/s降温至85℃，再以0.1℃/s降温至25℃。

6.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述带有A、T、G或C粘性末端的4种人工接头分别为：

接头A：

3’-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5’；

接头T：

3’-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5’；

接头G：

3’-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5’；

接头C：

3’-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5’。

7.如权利要求5所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述基于人工接头序列设计的正反向引物为：

AF：5’-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC-3’

AR：3’-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5’。