[发明专利]一种检测单碱基突变的方法及应用

说明书

本发明公开了一种检测单碱基突变的方法及应用，包括针对待测样本与参照的目标区段设计引物，PCR分别扩增；将扩增产物等量混合，高温变性再退火获得异质双链DNA，再经CEL I酶切，酶切产物电泳检测确定单碱基突变样本；回收其中被CEL I酶切开的两个片段，每个片段分别与带A、T、G或C粘性末端的接头连接；用于扩增目标片段的上下游引物中的一条和基于接头序列设计的正反向引物中的一条组成两对引物，分别以每个连接产物为模板，进行PCR扩增；电泳检测。本发明公开的检测单碱基突变的方法，既可以检测已知的单碱基突变，也可以筛查未知的单碱基突变，既可以确定突变的位置，又可以确定突变的类型，灵敏度高、重复性好又经济。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测单碱基突变的方法及应用。

背景技术

单核苷酸变异(点突变)是指在DNA特定位置发生一个核苷酸的改变，广泛存在于生物体遗传信息的编码中，当较少出现的等位基因频率大于或等于1％时，则称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。对点突变的研究有助于深入认识高等生物的遗传特性，解释个体的表型差异，揭示基因、信息、蛋白质的正常功能，变异的成因以及不同个体对环境变化的响应机制，对功能基因组学研究和建立分子标记都具有重要意义。

随着基因组测序工作的开展，点突变的检测和筛选正成为人们关注的焦点，检测方法也随之迅速发展；此外，当点突变所造成的基因理化特性改变比较微弱时，则使得点突变的检测非常困难，这也使得人们从多方面探索和建立新的检测方法。

PCR-RFLP是最早用于分析已知点突变的方法。如果点突变正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用PCR特异扩增的这段DNA经某一限制酶消化后，再通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，即可确定是否存在点突变。这种检测具有较高的特异性，重复性好，但仅适于涉及到特定限制性内切酶识别位点的突变检测和突变频率大于1％的多态性检测，不能提供究竟是何种碱基的突变。

依赖于DNA变性动力学的PCR技术和高分辨熔解曲线分析技术(high-resolutionmelting analysis，HRM)也能用于SNP的检测。扩增片段内若存在点突变，则通过Tm值的差异或变性过程中双链DNA饱和染料释放荧光信号强度的差异，可将存在错配碱基的双链DNA与纯合的双链DNA相区分开来。它们可以用于SNP的快速检测，但只适合于对小片段的分析，且不能确定具体的突变碱基与部位。

单链DNA由于碱基序列的不同可以引起其构象差异，这种差异将造成相同或者相近长度的单链DNA电泳迁移率的差别，即单链构象多态性(signle strand conformationpolymorphism，SSCP)。因此，目标基因通过PCR扩增、变性及电泳后，突变所引起的DNA构象差异则表现为电泳条带位置的差异而用于SNP的分析中。但是，单个碱基突变的检出率会随着DNA片段的长度的增加而降低，同时，SSCP不能够确定所分析DNA片段中突变的类型及位置并且耗时长。

当DNA在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳，即变性梯度凝胶中电泳(denaturedgradient gel electrophoresis，DGGE)时，具有碱基差异的DNA片段会在不同的地方开始解链，从而达到分离的目的。虽然DGGE检测的片段长度可以达到1kb，但是它耗时较长、使用条件较难优化并且不能确定所分析DNA片段中突变的类型和位置。