[发明专利]一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法

权利要求书

1.一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA；

(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；所述引物序列如下：

该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列；

(3)对步骤(1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增：对步骤(2)中筛选得到的引物进行组合，并通过优化PCR反应条件得到6组多重PCR组合；

所述的6组多重PCR组合如下：

(4)获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据：对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进行荧光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据；

(5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，以对长牡蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。

2.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在M13(-21)通用引物序列的5’端。

3.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50℃～60℃的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度。

4.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的引物组合和优化PCR条件具体操作为：首先将所述各引物两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构建；通过优化退火温度、引物浓度、反应体系最终得出6组多重PCR组合。

5.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法。

6.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的基因序列分析软件为Genemapper v4.0和Cervus 3.0。

7.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的长牡蛎子代DNA提取选取的实验材料是D形幼虫。