[发明专利]一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法

说明书

本发明公开了一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用18个微卫星位点及带荧光标记的M13（‑21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。经验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100%的鉴定成功率。本发明为长牡蛎提供了一套经济有效、准确度高的基于DNA标记的亲子鉴定技术。通过微卫星标记鉴定获得的系谱关系记录，可以将长牡蛎个体追溯到其产出地，从而建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，为解决当今社会人们日益关注的食品安全问题提供有力的技术支持。

技术领域

本发明涉及一种水产动物亲子鉴定的方法，具体涉及了一种采用微卫星多重PCR方法进行长牡蛎亲子鉴定的方法。

背景技术

微卫星标记方法具有多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR扩增等特点，是当今最流行的分子标记之一。在亲子鉴定中，相比于SNP标记，使用微卫星标记所需位点数少，但相对鉴定力可达5倍以上；微卫星标记方法不需特殊仪器，具有操作便捷、易于检测、省时高效以及准确度高的特点。

利用微卫星标记进行亲子鉴定，传统的分析方法是将PCR扩增产物在变性或者非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分型，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。这种方法存在许多不足之处，如判读误差较大、分辨率不高、操作无法自动化及存在有害物质、处理通量低等问题，不适合于大量样本的分析，也满足不了亲子鉴定对基因型分型的精度要求。

微卫星多重PCR方法是指在同一反应体系里加入多对引物，同时进行多个扩增反应，得到多个产物，因而具有提高反应效率，避免样品浪费，节约实验成本等优点。微卫星多重PCR在大黄鱼(Pseudosciaena crocea)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)，斑节对虾(Penaeus monodon)，以及虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai)等的亲权分析及系谱认证中均有应用。

长牡蛎(Crassostrea gigas)是世界上养殖范围最广、产量最大的经济贝类，素有“海中牛奶”之美誉，深受消费者青睐。为了确保食品安全和增强消费者对养殖牡蛎产品的信赖，建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，以实现从苗种到餐桌的全程质量控制至关重要。长期以来，养殖水产品大都采用物理方法进行标记，但是物理标记容易丢失和改变，可靠性较低。使用DNA标记进行跟踪具有标记稳定、可靠，且易于检测的优势。

因此，开发精确的适用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR技术体系对于开展养殖牡蛎产品的DNA鉴定具有重要意义。此外，牡蛎亲子鉴定技术在牡蛎种质资源保护、优良品种选育等方面也具有重要的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、鉴定准确率高的长牡蛎亲子鉴定的多重PCR方法，该方法采用加尾引物，能够快速、准确的对未知亲缘关系的长牡蛎亲本与子代间进行亲子鉴定，以弥补现有技术的不足。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA，其中长牡蛎子代选取的是D形幼虫，这是由于在海洋贝类中，经常会出现偏分离的微卫星等位基因，因此利用幼虫进行家系分析可以减少或排除偏分离位点的影响；

(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；