[发明专利]一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计含有限制性内切酶位点的线性滚环扩增模板，以目标microRNA为连接探针将线性滚环扩增模板连接成环，并以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以上述短单链为模板进行环介导扩增，实现信号的第二步放大；

具体包括以下步骤：

(1)首先针对目标microRNA设计一个5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，所述的线性滚环扩增模板包括三个区段：与目标microRNA一端互补的5’端区段、与目标microRNA其余片段互补的3’端区段及含有一个限制性内切酶位点的中间区段；

(2)模板环化过程：向含目标microRNA的体系中加入DNA连接酶和5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，目标microRNA与5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板碱基互补配对使5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板首尾相连，得到成环的滚环扩增模板；

(3)滚环扩增过程：向体系中加入dNTP和DNA聚合酶，37℃扩增4-6h，80℃灭活15min，以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，得到滚环扩增产物；

(4)切割过程：用限制性内切酶将滚环扩增产物切割成若干个完全相同的短单链；

(5)环介导等温扩增过程：以步骤(4)所述的短单链为模板进行环介导等温扩增，然后向环介导等温扩增产物中加入DNA显色剂，并用实时荧光定量PCR采集和分析扩增信号。

2.根据权利要求1所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的限制性内切酶位点为EcoR I酶的酶切位点。

3.根据权利要求1或2所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的含有一个限制性内切酶位点的中间区段为21nt。

4.根据权利要求1所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述的模板环化过程具体为：向含目标microRNA的体系中加入DNA连接酶缓冲液和5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，22～37℃放置0.5～1小时；然后再加入DNA连接酶，16～37℃连接2～24小时，65℃灭活15min。

5.根据权利要求1所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述的滚环扩增过程具体为：向体系中加入dNTP和DNA聚合酶，37℃扩增4-6h，80℃灭活15min。

6.根据权利要求1所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，步骤(4)所述的切割过程具体为：向体系中加入与中间区段互补的限制性内切酶互补序列，加水稀释，95℃退火1个小时，最后加入限制性内切酶，37℃酶切12～24小时，80℃灭活15min。

7.根据权利要求1所述的利用两步扩增法检测microRNA的方法，其特征在于，步骤(5)所述的环介导等温扩增过程具体为：将环介导等温扩增的四种引物、扩增缓冲液加入到步骤(4)得到的短单链中，95℃加热5min，接着骤冷到4℃；接着加入dNTP、DNA聚合酶、DNA显色剂，然后用超纯水定容，立即在实时荧光定量PCR上面65℃实时监控；根据出峰时间或者“S”曲线的拐点的时间，进行定量或者定性分析。