[发明专利]一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法

说明书

本发明涉及一种利用滚环扩增‑环介导等温扩增两步扩增法检测MicroRNA的方法。首先设计一个以目标microRNA为环化连接探针的线性滚环扩增模板，并以该线性滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以这些短单链为模板进行环介导扩增，实现信号的第二步放大。环介导等温扩增的扩增过程由实时荧光定量PCR监测，扩增的样品中加入DNA显色剂，当扩增的DNA产物增多时，DNA显色剂的荧光增强，其荧光信号被实时荧光定量PCR采集和输出。本发明采用两步扩增法放大microRNA的信号，是一种低背景高灵敏度的检microRNA的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种利用滚环扩增-环介导等温扩增两步扩增法检测MicroRNA的方法。

背景技术

微小RNA（microRNAs）是一种约21-23个碱基的内源非编码小RNA，长度约为21-22个核苷酸，其长度变化范围也可以从19到25个核苷酸不等。MicroRNA在体内一般是由两步酶解过程产生，最原始的是pri-microRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-microRNA经过一次加工后，成为pre-microRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-microRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟microRNA。具体原理如下：pri-microRNA经过Drosha酶消化得到一个茎-环结构的pre-microRNA，Drosha酶存在于细胞核中，而Drosha催化的酶切过程也常在细胞的这一区域进行。Exportin 5蛋白将pre-microRNA从核中转运至细胞质。随后pre-microRNA被Dicer酶在细胞质中剪切得到双链RNA，解链后成为成熟的microRNA。MicroRNA对靶基因mRNA的作用有三种方式:（1）切断靶基因的mRNA分子；（2）抑制靶基因mRNA的翻译；（3）结合抑制。研究发现microRNA可以作为重要的疾病标志物，大量研究证实其与多种重大疾病息息相关，在很多疾病的早期阶段，microRNA谱会有特征性的异常。因此如果能够在microRNA变异的早期能够及时地加以检测，将会大大有助于重大疾病的早期预警、早期诊断以及预后治疗。并且想要进一步确定microRNA在基因调控中的重要地位，关键是要迅速、准确地定量检测microRNA。

目前检测MicroRNA的方法比较成熟主要有Northern印迹分析、微点阵（microarray）分析和实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）。Northern印迹分析和微点阵（microarray）需要的样品大、检出限高、线性范围窄、分析周期长、特异性差，已经不能满足现代分析要求。实时定量PCR较前两者而言有明显优势，需要样品量少、检出限较低、线性范围宽，分析时间相对缩短，特异性高，已成为一种定量MicroRNA的标准方法。随着时代发展，这三种检测手段均已不能满足人类需求，对于实际样品的分析检测亟需更灵敏的检测手段。滚环扩增（RCA，rolling circle amplification）是90年代中期发展出一种新的核酸等温扩增方法，能实现10⁵-10⁹倍的扩增效率。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）技术是2000年日本学者提出的一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，能实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增效率，目前已发展成为成熟的疾病检测技术。而我们的实验则是运用一种巧妙的方法将滚环扩增技术和环介导等温扩增技术相结合，以期实现MicroRNA的超灵敏检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种microRNA特异性的超灵敏低背景的利用滚环扩增和环介导等温扩增两步扩增法检测microRNAs的方法。

本发明的技术方案具体如下：