[发明专利]检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说，涉及一种检测水稻抗稻 瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。

背景技术

由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的水稻稻瘟病是对水稻生产 危害最严重的病害之一，每年可造成的10～30％减产。选育与利用抗 病品种，是防治稻瘟病最安全有效的方法。经湖南稻瘟病病圃多年鉴 定，水稻品种“谷梅4号”一直为高抗品种。以“谷梅4号”为供体，选 育并推广的水稻品种已广泛应用于商业化育种中，其抗稻瘟病性表现 稳定高抗。

“谷梅4号”所携带的Pigm基因是抗谱广且抗性持久的基因之一。 Pigm基因被定位于水稻品种“谷梅4号”第6号染色体 10367284～10421563的片段内。目前，用于检测该基因的分子标记多 为显性或非紧密连锁标记，检测结果易引起误判；检测过程中使用的 EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。开发与抗稻 瘟病基因Pigm共分离的特异性分子标记及建立高效、环境友好的相 关检测体系，则对促进Pigm基因在商业化育种中的应用具有重要意 义。基于TaqMan探针的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR 过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一 致；检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB 对环境的污染、甲醛对人体的危害。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快 速、可靠、灵敏度高、特异性强和成本低的检测水稻抗稻瘟病基因Pigm 的引物、试剂盒及基因分型方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明按照如下方法获取探针及引物：

a.采用植物DNA提取方法获得水稻基因组DNA，作为下游实验的 模板；

b.对多个水稻稻瘟病抗性基因Pigm的等位基因与“谷梅4号”近 等基因系序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因的1 个碱基差异位点；

c.根据TaqManMGB探针的设计原理和设计方法，针对上述位点 设计TaqManMGB分型探针、引物；

d.对所设计的探针、引物进行筛选，从中筛选出优化地特异性探 针、引物；并优化出合适的PCR反应体系和反应条件。

本发明选定的用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基 因型分析PCR引物包括：

上游引物S1806GC-F：5’-ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAA ACGT-3’；

下游引物S1806GC-R：5’-CGCCTCTCCAGATTTGCAGTAT-3’。

本发明选定的配合上述引物使用的探针包括：

S1806-VIC：5’-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3’；

S1806-FAM：5’-CCCAAATGTTAGACATCATA-3’。

其中，VIC、FAM均为荧光报告基团。

本发明还提供了采用前述探针和引物制成的用于水稻抗稻瘟病 Pigm基因分型检测的试剂盒。

进一步地，本发明还提供一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman 定性基因型分析方法，该方法包括以下步骤：

1)提取待测水稻的基因组DNA，调整浓度至20-25ng/μl左右；

2)利用前述探针和引物，通过TaqMan实时荧光PCR仪ABI7500 对水稻基因组DNA进行基因分型检测，获得多组分图谱和基因分型 图；根据多组分图谱，判断是否有荧光信号收集；根据基因分型图， 判断基因类型：基因分型结果为GG或GC的水稻基因组，表明存在抗 稻瘟病基因Pigm。

本发明优选的PCR反应体系以20μl计为：2×TaqMan^{GenotypingMasterMix10μl，20×TaqManSNPGenotypingAssays 1μl，20-25ng/μlDNA4μl，ddH₂O补足至20μl。}