[发明专利]一种产L-色氨酸基因工程菌及其构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种产L-色氨酸基因工程菌及其构建方法与用途。

背景技术

色氨酸，学名β-吲哚基丙氨酸(β-indolylalanine)，是人体和动物生命活动中必 需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基 酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在医药领域，色氨酸是氨基酸输液的重要组分和 重要的医药中间体。在食品应用领域，色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促 进发酵。在饲料添加领域，当赖氨酸和蛋氨酸得以满足之后，色氨酸成为日粮重要限制性氨 基酸，补充外源色氨酸可以提高畜、禽、鱼类日粮内色氨酸的含量，改善日粮氨基酸组成和 比例，提高日粮蛋白质的价值和利用效率。

目前L-色氨酸的生产方法主要有四种，包括蛋白水解法、化学合成法、酶促转化法 和生物发酵法。蛋白水解法和化学合成法分别存在着原材料来源有限、生产工艺和步骤多、 光学拆分难且得率低、生产周期长等缺点，在工业生产中受到极大限制。酶促转化法具有终 产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，是生产L-色氨酸的有效方法，曾被世界 各国广泛用于L-色氨酸的工业化生产。但酶促转化法生产L-色氨酸的底物L-丝氨酸和吲哚 的价格昂贵，且吲哚难溶于水，对色氨酸合成酶抑制强烈，影响转化率的提高，导致酶促转 化法生产L-色氨酸的成本居高不下。故生物发酵法是目前广泛应用于工业生产L-色氨酸的 主要方法。

生物发酵法生产L-色氨酸的研究始于二十世纪60年代初期，但在之后相当长的一 段时期内达不到工业化生产的要求，主要原因是从葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途径漫 长，其代谢流也比较弱，且L-色氨酸合成需要多种前体物(如L-丝氨酸，谷氨酰胺，PRPP等)。 另一方面，L-色氨酸生物合成途径中的代谢调控机制也比较复杂。

1979年，Tribe和Pittard利用DNA重组技术首次将trpE基因引入大肠杆菌 (Escherichiacoli)，L-色氨酸产量达到1g/L(TribeDE,PittardJ.Hyperproductionof tryptophanbyEscherichiacoli:geneticmanipulationofthepathwaysleading totryptophanformation.ApplEnvironMicrobiol,1979,38(2):181–190.)。

此后，随着基因重组技术在微生物育种中的广泛应用，L-色氨酸生产菌株的筛选 技术取得了重大突破，L-色氨酸产酸水平也得到了巨大提高。

1996年，Berry在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制(feed-backresistance，fbr) 的aroG^fbr和trpE^fbrDCBA基因，发酵52小时产L-色氨酸近45g/L，过程最高糖酸转化率约为 22％(BerryA.ImprovingproductionofaromaticcompoundsinEscherichiacoli bymetabolicengineering.TrendsBiotechnol,1996,14(7):250–256.)。

1999年，Ikeda等在产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) pIK9960中高表达tktA基因，增加L-色氨酸合成前体E4P的水平，从而提高L-色氨酸的合成 效率，发酵80小时的L-色氨酸产量达到58g/L(IkedaM,KatsumataR.Hyperproductionof tryptophanbyCorynebacteriumglutamicumwiththemodifiedpentosephosphate pathway.ApplEnvironMicrobiol,1999,65(6):2497–2502.)。

另外，以重组大肠杆菌为宿主菌生产L-色氨酸的授权专利还有WO9408031A1、 EP0293207、US4371614、US4588687、CN1289676C、CN100582220C和CN101622338B等。这些专 利保护其新构建的位点，也描述了它们不同发酵产酸的能力。

大肠杆菌可通过多种途径转运并磷酸化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖(图1)，然后将 其导入糖酵解途径。