[发明专利]雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用

权利要求书

1.一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)收集活体南方根结线虫雌成虫，4℃2％多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22℃4h；

(2)将浸泡的线虫去上清，加400μL 0.1×固定液重悬浮线虫，吸置DEPC处理过的载玻片，用针灸针把成虫的前体部扎1-2个小孔，然后将雌根结线虫虫体收集到灭菌处理后的96孔板中；

(3)将收集的线虫用0.1×M9缓冲液漂洗2次，每次1min；

(4)裂解缓冲液22℃处理22min；去上清；

(5)0.1×M9缓冲液漂洗2次，每次1min；

(6)去上清，-78℃的干冰中处理20min；

(7)-20℃甲醇处理1min，去上清；

(8)-20℃丙酮处理1min，去上清；

(9)加入20％的丙酮，22℃水浴20min，去上清；

(10)预杂交：加入250μL 55℃预热的杂交液，45℃轻摇1h；

(11)探针变性：探针在沸水中变性10min，并迅速置于冰水中≥5min，获得变性的探针；

(12)将变性的探针加入到250μL 55℃预热杂交液中，混匀，获得终浓度为50ng/μL的混有探针的杂交液；

(13)将预杂交后的线虫去除预杂交液，加入混有探针的杂交液，避光45℃杂交18h；

(14)步骤(13)杂交完成后，倒去杂交液，在45℃、4×SSC缓冲液中洗15min，去上清，重复3次；

(15)线虫于37℃NTE缓冲液中洗10min，去上清；

(16)加入RNAse A消化未杂交探针，37℃处理1h；

(17)线虫于45℃，0.1×SSC缓冲液，0.1％SDS中洗20min，去上清，重复3次；

(18)在22℃马来酸缓冲液中浸泡5min去上清；

(19)加入适量新鲜配制的0.1×封闭液22℃保温30min；去上清；

(20)新鲜配制的0.5mL抗体溶液22℃反应2h，去上清；

(21)在洗涤缓冲液中浸泡15min去上清，重复3次；

(22)检测缓冲液中平衡5min；去上清；

(23)加入250μL新鲜配制的显色液试剂，4℃放置暗处，不要动摇；显色16h；

(24)去上清，M9缓冲液漂洗2次，每次1min，停止显色，实现雌根结线虫食道腺基因原位杂交；

为防止雌根结线虫虫体破裂，在上述步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(24)中均不需要离心，直接去上清液。

2.根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：步骤(4)中所述的裂解缓冲液为含0.5mg/mL蛋白激酶K的M9Buffer。

3.根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：步骤(11)中所述的探针为根结线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针。

4.根据权利要求3所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：所述的根结线虫食道腺基因的原位杂交RNA探针为MiPDCD6基因的原位杂交RNA探针。

5.根据权利要求4所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：所述的MiPDCD6基因的原位杂交RNA探针由引物In-PD-T7F和引物In-PD-R扩增获得；其引物序列如下：

In-PD-T7F如SEQ ID NO：1所示；

In-PD-R如SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求1所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法，其特征在于：步骤(16)中所述的RNAse A为由NTE buffer稀释成60μg/mL的RNAseA。

7.权利要求1～6任一项所述的雌根结线虫食道腺基因原位杂交方法应用于检测目的基因在雌根结线虫食道腺中的表达部位的用途。