[发明专利]雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用

说明书

本发明公开了一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用，属于雌根结线虫基因表达检测技术领域。本发明针对雌根结线虫虫体易破裂的特点，在原位杂交的过程中采用针灸针在雌根结线虫成虫的前体部轻轻地扎1‑2个小孔，提供了避免虫体破裂的方法；本发明还提供了雌根结线虫的固定技术；本发明改用96孔板实验可以减少虫体挪动，避免了离心管中因大量虫子聚集挤压造成的变形，而且雌虫体积较大，较重，不需要离心即能沉到底部，省去离心的步骤，能更好的维持虫体不变形。通过技术创新，在南方根结线虫雌成虫食道腺中实现了基因的原位杂交。

技术领域

本发明涉及雌根结线虫基因表达检测技术，具体涉及一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术及其应用。

背景技术

原位杂交组织化学技术(简称原位杂交In situ hybridization，ISH)是利用带有标记物的核酸(DNA或RNA)探针检测组织或细胞内待测核酸的表达和分布情况，已知序列的探针和组织或细胞内的待测核酸通过碱基互补配对结合，探针上带有的特定标记物，可以和相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学的方法在待测核酸的原位形成有色的杂交信号；尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，是分析低丰度和罕见的mRNA表达的重要技术，已成为最有效的分子病理学技术。

根结线虫(Meloidogyne spp.)可以寄生2000多种植物，给农作物生产带来严重损失；根结线虫生活史在25约28天；包括卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫和和成虫阶段；其中二龄幼虫呈线形，雌成虫膨大呈球形或柠檬形(图1)；雌根结线虫虫体体积最大，在寄主体内存活时间较长。

根结线虫在一个生长季节可以繁殖3-4代，每代的繁殖量很大，平均每条雌虫可产生300-500个卵，雌根结线虫能够成功产卵，是造成作物连作基地根结线虫虫口密度不断上升的关键因素；但由于雌根结线虫在植物体内，常规的防治技术难对其进行防治；近年来发展起来的基因沉默技术以及转基因技术，可望创制出抗根结线虫病植物材料。

运用原位杂交技术对根结线虫中基因表达部位的研究已经有多篇报道，多种食道腺分泌蛋白已成功在南方根结线虫二龄幼虫上进行定位；但是所有报道均是对呈线状虫体的根结线虫二龄幼虫原位杂交技术。未见呈球形的雌根结线虫原位杂交技术。

鉴于雌根结线虫在寄主体内存活时间较长(15-18天)，对其寄主巨型细胞的调控中起到重要作用，因此建立针对雌根结线虫的食道腺基因的原位杂交技术具有重要的科学意义和实践意义。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的首要目的是提供一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术。本发明人通过查阅已经发表的基因原位杂交文献，针对雌根结线虫虫体易破裂的特点，设计并筛选出防止雌根结线虫虫体破裂的系列技术，从而成功建立了雌根结线虫食道腺基因的原位杂交技术。

本发明的另一目的在于提供上述雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：一种雌根结线虫食道腺基因原位杂交技术，包括如下步骤：

(1)收集活体南方根结线虫雌成虫，4℃2％多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22℃4h；

(2)将浸泡的线虫去上清，加400μL 0.1×固定液重悬浮线虫，吸置DEPC处理过的载玻片，用针灸针把成虫的前体部扎1-2个小孔(避免把虫体弄破)，然后将雌根结线虫虫体收集到灭菌处理后的96孔板中；

(3)将收集的线虫用0.1×M9缓冲液漂洗2次，每次1min；

(4)裂解缓冲液22℃处理22min；去上清；

(5)0.1×M9缓冲液漂洗2次，每次1min；

(6)去上清，-78℃的干冰中处理20min；

(7)-20℃甲醇处理1min，去上清；