[发明专利]棘白菌素B的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取纯化方法。更具体地说，本发明涉及一种棘白菌素B的提取纯化 方法。

背景技术

20世纪70年代，人类首次发现了具有抑制真菌细胞壁合成物质——棘白菌素类化合 物，酰胺、丝氨酸、苏氨酸和鸟氨酸，不同的氨基酸以及脂肪酸侧链导致了棘白菌素类药 物的化学多样性。棘白菌素B的开发具有较好的市场前景。但由于其生产难度较高，纯化 难度大。

真菌感染疾病，尤其是深部真菌感染疾病的发病率和致死率逐年增加，因此抗真菌药 物的研发将会成为人类面临的一个难题。棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然 产物，由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，通过非竞争性作用抑制细胞壁中 B.(1，3)一D一葡聚糖的合成，而发挥其抗真菌作用。棘白菌素类药物具有作用机制独特， 不良反应率低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性等特点。

对棘白菌素B的分离有比较大的难度，先前用各种方法分离到的棘白菌素B的纯度都 不高，US6506726将发酵液酸化以后使用HP20、SP825、SP207等大孔树脂分离纯化棘白 菌素B，但是该方法分离到的产物的纯度低，产品含量最多只能到80％左右，不符合目前 市场上对该产品的要求。US4288549中采用了硅胶层析、萃取等方法得到棘白菌素B的方 法，但是该方法采用了压力柱，而且对色素的分离也比较难，同样导致纯度不高。国内公 开号为CN103724403A的专利，提供了另外一种从发酵液中分离棘白菌素B的方法，该方 法通过发酵提取，同样也是从反向硅胶中分离纯化，但该方法步骤非常长，操作繁琐，导 致对棘白菌素B的提取率比较低。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提高棘白菌素B产品的提取率和产品纯度，降低生产成本。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种棘白菌素B的提取纯化方法，包 括如下步骤：

步骤一、酸化棘白菌素B的发酵液，过滤获得菌丝体滤液；

步骤二、将步骤一得到的菌丝体滤液通过以浓缩分离超滤膜为组件的超滤设备，调节 温度为25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为3.0～5.0L/h进行浓缩，得到分离后的透过 液；

步骤三、将步骤二得到的透过液通过以钠滤膜为组件的超滤设备，调节温度为 25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为1.0～3.0L/h进行浓缩，得到浓缩液；

步骤四、用凝胶柱将步骤三得到的浓缩液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，得到棘白 菌素B的粗品；

步骤五、将步骤四得到的棘白菌素B的粗品重结晶、加热回流和冷却干燥后，得到棘 白菌素B的纯品。

采用对发酵液提取、超滤大分子、钠滤小分子、凝胶柱分离、重结晶、加热回流和冷 却干燥，得到棘白菌素B的纯品，操作简单方便，降低了生产成本。同时，操作提取过程 在较低温度下进行，对棘白菌素B无破坏作用，不会产生多余杂质，提高了产品的收率及 产品的质量。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，所述步骤一中，棘白菌素B的发 酵液用稀酸调节pH值为4.5～5.5，搅拌30～50min后，离心得到菌丝体，然后在菌丝体中 加入3～7倍体积的乙醇，搅拌1～5小时，过滤后获得菌丝体滤液。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，所述稀酸为稀盐酸、稀硫酸、磷酸 或醋酸中的任一种。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，所述稀酸为稀盐酸。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，所述步骤三中，浓缩液中加入浓缩 液1～4倍体积的乙醇，搅拌1～5小时，于-10～0℃下析出固体备用。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，所述步骤四中，将凝胶柱装柱后， 先用体积比为1:1的甲醇和水进行一次洗脱，洗脱液回收，然后用体积比为5:1～2:1的甲 醇和水进行二次洗脱，流速为1.0～2.0L/h，收集洗脱液，将两次的洗脱液回收置于20～50℃ 下浓缩至干，得到棘白菌素B的粗品。

优选的是，所述的棘白菌素B的提取纯化方法中，对凝胶柱进行二次洗脱时，甲醇和 水的体积比为3：1。