[发明专利]农药西维因分子印迹仿生快速检测试纸条的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子印迹技术，特别涉及基于滤纸为固相载体制备农药西维因分子印迹仿生快速检测试纸条及其应用。

背景技术

西维因，又称甲萘威、胺甲萘，是世界上第一个商品化且大量使用的高效低毒氨基甲酸酯类杀虫剂，广泛用于防治麦、稻、棉、蔬菜、果树等作物的害虫、畜禽外寄生虫等，与有机磷农药混合使用对多种农业害虫具有明显的增效作用。西维因含有一个N-甲基基团,为白色晶体,难溶于水,易溶于有机溶剂如丙酮、二氯甲烷等,在碱性和高温条件下很易被水解。西维因具有中等毒性，可以经过皮肤、消化系统、呼吸系统进入生物体，进入生物体的西维因通过抑制胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱在组织中蓄积，干扰生物体正常的分泌系统，因此具有致畸、致癌、致突变的作用。目前,西维因残留的检测方法主要包括气相色谱-质谱联用法、固相萃取法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。仪器分析检测技术对样品的前处理以及检测条件要求较高，耗时较长，对操作人员要求较高。食品流通从市场到消费者速度快，范围广，为及时确保消费者的食品安全，研究开发快速有效的检测方法势在必行。

分子印迹技术主要是将模板分子与功能单体通过共价键或非共价键作用,加入交联剂,在引发剂及溶剂的作用下通过热引发或光引发实现聚合反应。洗去模板分子后的分子印迹聚合物中留有在空间大小和形状以及化学作用等方面都与模板分子相匹配的孔穴,可以特异性与模板分子结合。由于分子印迹具有构像预定性、特异识别性和广泛的适用性，在许多领域得到深入的研究和开发。近些年，该技术已被广泛用于色谱分离、生物传感器、抗体和受体模拟等诸多领域，成为一个化学和生物学交叉的新兴领域。

以生物抗体为识别元件的免疫分析法中尤以酶联免疫法(ELISA)研究最多，广泛用于各种农兽药小分子危害残留物的定性和定量检测。因ELISA具有快速、简便等优点，目前市场上已有商业化使用的酶联免疫试剂盒及试纸条。试纸条与试剂盒相比前者以定性为主，后者以定量为主，但前者更易携带、更快检测，在现场检测时能快速判定是否含有某种物质，含量是否超过标准。目前免疫分析法所面临的主要问题是生物抗体的制备(特别是小分子化合物的生物抗体)，生物抗体的制备周期长、操作繁复，且制得的抗体特异性难以保障，特别是农药等小分子化合物，制备质量稳定的生物抗体具有一定难度。另外生物抗体对外界环境较为敏感，易失去活性，易造成假阳性结果使其应用受限，研究人员不断对其进行改进，目前有研究报道将分子印迹作为人工抗体替代生物抗体应用于ELISA，称之为仿生酶联免疫(BELISA)。分子印迹聚合物表现出对目标物的特异性吸附与天然抗体对抗原的高度亲和性和专一性相类似，因此将印迹聚合物替代生物抗体用于小分子物质的免疫分析是完全可实现的。

发明内容

本发明的目的是填补当前尚未有的西维因分子印迹仿生快速检测试纸条的空白。提供一种以滤纸为固相载体，制备过程简单，制备产品理化性能好、检测灵敏度较高的快速检测试纸条的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

采用Whatman NO.5滤纸作为固相载体，通过在其纸纤维表面硅烷化后引入功能双键。将西维因、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)溶于氯仿，加入预先硅烷化的滤纸载体，水浴热引发，在滤纸纤维素表面制备西维因分子印迹聚合物。模拟生物抗体与抗原和酶标抗原竞争性免疫结合反应机理，利用西维因酶标抗原作为反应标记物与西维因竞争结合滤纸上西维因分子印迹聚合物的印迹孔穴位点(仿生抗体)，底物显色后通过判断检测纸片上颜色变化从而定性检测样本中西维因含量。

农药西维因分子印迹仿生快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

(1)固相载体的预处理：

Whatman NO.5滤纸于真空干燥箱预干燥以除去水分，浸泡于含γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS的乙醇溶液中，干燥箱固定后切割成一定直径的圆形纸片；

(2)西维因分子印迹仿生试纸条的制备：

将模板分子西维因、功能单体MAA、交联剂EGDMA、引发剂溶于氯仿，加入经步骤(1)预先处理过的纸片，脱气后，水浴中进行热聚合反应，得到西维因分子印迹仿生试纸条；

(3)模板分子的去除：

用甲醇-醋酸混合溶液索氏提取模板分子，反复操作，直到检测不出模板分子为止，真空干燥至恒重。

步骤(1)中，所述乙醇溶液中γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的质量百分浓度为0.5-0.6％，所述乙醇溶液的浓度为80％。